CRISPR/Cas9基因敲除,敲入怎么做,原理
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发布时间：2022-04-25 14:27
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热心网友
时间：2023-01-25 08:25
依靠一个复合物，该复合物能在一段RNA指导下，定向寻找目标DNA序列，然后将该序列进行切除。
基因敲除是用含有一定已知序列的DN*段与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组，整合至受体细胞基因组中并得到表达的一种外源DNA导入技术。
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热心网友
时间：2023-01-25 09:43
说到基因敲除敲入，肯定要先说说CRISPR/Cas基因编辑系统
CRISPR/Cas（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/Cas）系统是目前被广泛运用的基因编辑系统，其原理是由CRISPR转录产生的gRNA介导Cas核酸酶靶向目标序列，对序列进行切割。
CRISPR/Cas9基因编辑示意图
(图源：Wellcome Trust Sanger Institute,Sanger)
然后我们再来讲讲敲除和敲入
CRISPR/Cas基因敲除
CRISPR/Cas9系统中sgRNA(smallguideRNA)识别并结合目标基因的靶向序列，引导Cas9对结合位点进行剪切，产生DNA双链断裂（double-strandbreak,DSB），机体自身通过非同源重组（non-homologousendjoining，NHEJ）的方式修复DSB，参与修复的蛋白经常会在DNA末端插入或删除几个碱基，修复后的基因由于产生突变而导致功能丧失，从而实现机体内的基因敲除。
应用：基因敲除细胞系建立、基因敲除建立动物疾病模型。
技术优势：相较于在mRNA水平“敲低”目的基因的RNAi而言，CRISPR/Cas9系统造成基因序列的缺失，从而能完全沉默（即敲除）目的基因。
CRISPR/Cas基因敲入
CRISPR/Cas9系统中sgRNA(smallguideRNA)识别并结合目标基因的靶向序列，引导Cas9对结合位点进行剪切，产生DNA双链断裂（double-strandbreak,DSB），通过细胞内的同源重组（homologousrecombination，HR）修复方式，将外源供体DNA定点导入至基因组的靶位点中，从而实现基因敲入。
应用：基因片段敲入细胞系建立、基因单碱基突变细胞系建立、基因敲入建立动物疾病模型。
技术优势：操作简易、效率高、具有广谱性且提供BSL-1和BSL-2病毒注射及实验操作平台。
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热心网友
时间：2023-01-25 11:17
1.利用基因同源重组进行基因敲除
基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重组原理发展起来的。80年代初，胚胎干细胞(ES细胞)分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。1985年，首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。到1987年，Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型。直到现在，运用基因同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中最普遍的使用方法。
2.诱导性基因敲除也是以Cre/loxp系统为基础，但却是利用控制Cre表达的启动子的活性或所表达的Cre酶活性具有可诱导的特点，通过对诱导剂给予时间的控制或利用Cre基因定位表达系统中载体的宿主细胞特异性和将该表达系统转移到动物体内的过程在时间上的可控性，从而在1oxP动物的一定发育阶段和一定组织细胞中实现对特定基因进行遗传修饰之目的的基因敲除技术。人们可以通过对诱导剂给予时间的预先设计的方式来对动物基因突变的时空特异性进行人为控制、以避免出现死胎或动物出生后不久即死亡的现象。常见的几种诱导性类型如下：四环素诱导型；干扰素诱导型;激素诱导型;腺病毒介导型。
热心网友
时间：2023-01-25 13:25
crispr/cas9可谓是目前基因编辑领域最热门的明星工具，从2014年张锋教授结合CRISPR技术和二代测序技术开发了对人类全基因组的CRISPR敲除文库，并在肿瘤细胞系上利用该文库进行了抗药基因的筛选。在获得阳性基因的基础上获得了新的抗性基因，发表在了science杂志上。到目前，中国在CRISPR领域的研究处于世界领先水平，国家基因的申报中频发出现CRISPR/CAS9技术的应用，含有这项技术的文章也更容易发表高分文章。
