CRISPR/Cas9在研究基因功能中的应用是怎样的？
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发布时间：2022-04-21 06:30
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时间：2023-11-06 15:30
基因敲除动物模型一直以来是在活体动物上开展基因功能研究、寻找合适药物作用靶标的重要工具。但是传统的基因敲除方法需要通过复杂的打靶载体构建、ES细胞筛选、嵌合体小鼠选育等一系列步骤，不仅流程繁琐、对技术的要求很高，而且费用大，耗时较长，成功率受到多方面因素的*。即使对于技术比较成熟的实验室，利用传统技术构建基因敲除大、小鼠一般也需要一年以上。[3]
2013 年 1 月份，美国两个实验室在《Science》杂志发表了基于 CRISPR-Cas9 技术在细胞系中进行基因敲除的新方法，该技术与以往的技术不同，是利用靶点特异性的 RNA 将 Cas9 核酸酶带到基因组上的具体靶点，从而对特定基因位点进行切割导致突变。该技术迅速被运用到基因敲除小鼠和大鼠动物模型的构建之中。通过一系列研究，首先证明了通过 RNA 注射的方式将 CRISPR-Cas 系统导入小鼠受精卵比 DNA 注射能更有效的在胚胎中产生定点突变。在此基础上，又发现了该方法没有小鼠遗传品系的*，能够对大片段的基因组 DNA 进行删除，也可以通过同时注射针对不同基因的 RNA 序列达到在同一只小鼠或大鼠中产生多个基因突变的效果。此外，还证明了利用 CRISPR-Cas 技术构建的基因敲除大鼠模型与传统方法构建的同一基因（肥胖相关 G 蛋白偶联受体 Mc4R）突变大鼠相比具有一致的表型。该方法构建的基因突变动物具有显著高于传统方法的生殖系转移能力，是一种可靠、高效、快速的构建敲除动物模型的新方法。[3]
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时间：2023-11-06 15:30
1. 更彻底的（但不是更方便的）单个基因的knockout
相比shRNA、siRNA敲除更彻底（很多时候shRNA敲除效果不好，4、5个shRNA都不work，如果载体选择不好的话敲除不稳定），Crispr的话只要不是lethal的基因都能敲干净。相比TALEN之类的话更方便。但CRISPR需要挑细胞单克隆，慢慢长起来之后再一个一个colony看基因型，耗时长工作量大，不像shRNA一样包病毒感染直接杀就好了。这个具体要看你的基因、细胞系、实验目的之类的了。
2. 更方便的高通量文库敲除，基因筛选
虽然在敲单基因的时候麻烦，但如果是做高通量筛选就方便很多了。所有细胞转上Cas9，再把文库里的所有gRNA一起转进去，筛表型做个deep sequencing找找是哪个gRNA就好了，比shRNA筛选简单多了。（参考文章：Phil Sharp和Feng Zhang合作的Genome-wide CRISPR Screen in a Mouse Model of Tumor Growth and Metastasis.）
3. 更好的动物模型建造
CRISPR可以更方便的造转基因鼠（特别是在癌症领域），敲进敲除器官conitional之类的都能实现，比传统方法简便效果好（参考文章：Tyler Jacks组的CRISPR-mediated direct mutation of cancer genes in the mouse liver）
4. 其他新应用
比如更方便的实现chromosomal rearrangement（Sloan Kettering一个意大利PI做的，有兴趣可以搜一下），gene fusion之类的。
关系Crispr的新动向、新应用的话，建议看一下几个元老(Feng Zhang，Jennifer Doudna，George Church)主页的publication。他们是crispr领域的领跑者：
Zhang Lab @ MIT
The Doudna Lab
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时间：2023-11-06 15:30
CRISPR/Cas9 是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。CRISPR/Cas9 系统通过将入侵噬菌体和质粒 DNA 的片段整合到 CRISPR 中，并利用相应的 CRISPR RNAs（crRNAs）来指导同源序列的降解，从而提供免疫性。[1] 2002年，荷兰乌得勒支(Utrecht)大学的Ruud.Jansen在Molecularmicrobiology杂志上发表了题为Identification of genes that are associated with DNA repeats inprokaryotes的文章，他们利用生物信息工具对一系列古菌和细菌的重复序列进行了分析。文章中，Jansen等人在Mojica的协商下(文章中致谢里面提到的)，首次将这个重复序列命名为Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats,简称CRISPR，这就是我们现在所通用的名称。同时，他们也首次用了CRISPR-associated(cas)这个概念。另外，他们对各种细菌和古菌的相关cas基因进行了鉴定，其中包括后面热门研究的嗜热链球菌(Streptococcusthermophiles)与酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)的cas3、cas4、cas1、cas2基因。
