RNA的提取方法
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发布时间：2022-04-21 06:30
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时间：2023-09-26 12:05
1、酚抽提法：先用蛋酶K、SDS破碎细胞，消化蛋白，然后用酚和酚-氯萃取，高速离心后取上清，所得DNA大小为100-150kb
2、甲酰胺解聚法：破碎细胞同上，然后用高浓度甲酰胺解聚蛋白质与DNA的结合，再透析获得DNA可得DNA200kb左右。
3、玻璃棒缠绕法：用盐酸胍裂解细胞，将裂解物铺于乙醇上，然后用带钩或U型玻璃棒在界面轻搅，DNA沉淀液绕于玻棒。生成DNA约80kb。
4、异丙醇沉淀法：基本同1法，仅用二倍容积异丙醇替代乙醇，可去除小分子RNA（在异丙醇中可溶状态）
5、表面活性剂快速制备法：用Triton X-100A或NP40表面活性剂破碎细胞，然后用蛋白酶K或酚去除蛋白，乙醇沉淀或透析。
6、加热法快速制备：加热96℃-100℃，五分钟，然后离心后取上清，可用于PCR反应。
7、碱变性快速制备：先用NaOH作用20分钟，再加HCI中和，离心后取上清，含少量DNA。
扩展资料：
DNA提取原则：
1、保证核酸一级结构的完整性；
2、核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；
3、其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度；
4、其他核酸分子，如RNA，也应尽量去除。
参考资料来源：百度百科——DNA提取
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时间：2023-09-26 12:06
实验三 酵母RNA的提制（浓盐法）
一、目的
学习和掌握从酵母中提制RNA的原理和方法，以加深对核酸性质的认识。
二、原理
酵母含 RNA 2.67％～10.0％，DNA很少（0.03％～0.516％），而且菌体容易收集，RNA也易于分离，所以选用酵母为实验材料。
RNA提制过程是先使RNA从细胞中释放，并使它和蛋白质分离，然后将菌体除去。再根据核酸在等电点时溶解度最小的性质，将pH调至2.0～2.5，使RNA沉淀，进行离心收集。
提取RNA的方法很多，在工业生产上常用的是稀碱法和浓盐法。前者利用稀碱溶解细胞壁，使RNA释放出来，这种方法提取时间短，但RNA在此条件下不稳定，容易分解；后者在加热的条件下，利用高浓度的盐改变细胞膜的透性，使RNA释放出来，此法易掌握，产品颜色较好。
三、仪器、试剂和材料
1．仪器
（1）量筒（50ml）
（2）三角瓶（100ml）
（3）烧杯（250ml，50ml，10ml）
（4）布氏漏斗（40mm）
（5）吸滤瓶（125ml）
（6）表面皿（6cm）
（7）751型分光光度计
（8）离心机（4000r／min）
（9）恒温水浴
（10）药物天平
（11）烘箱
2．试剂
（l）NaCl（化学纯）
（2）6mol／L HCI
（3）95％乙醇（化学纯）
3．材料
鲜酵母或干酵母；pHO.5～5.0的精密试纸。
四、操作步骤
1．提取
称取鲜酵母 159或干酵母粉 2.5g，倒入 100ml三角瓶中，加 NaCl 2.5g，水25ml，搅拌均匀，置于沸水浴中提取lh。
2．分离
将上述提取液用自来水冷却后，装入大离心管内，以4000r／min离心10min，使提取液与菌体残渣等分离。
3．沉淀RNA
将离心得到的上清液倾于50ml烧杯内，并置入放有冰块的250ml烧杯中冷却．待冷至10℃以下时，用6mol／L HCI 小心地调节pH值至2.0～2.5（注意严格控制pH）。调好后继续于冰水中静置10min，使沉淀充分，颗粒变大。
4．洗涤和抽滤
上述悬浮液以 4000r／min离心 10min，得到 RNA沉淀。将沉淀物放在 10ml小烧杯内，用95％的乙醇 5～10ml充分搅拌洗涤，然后在布氏漏斗上用射水泵抽气过滤，再用 95％乙醇5～10ml淋洗 3次。
5．干燥
从布氏漏斗上取下沉淀物，放在6cm表面皿上，铺成薄层，置于80℃烘箱内干燥。将干燥后的RNA制品称重，存放于干燥器内。
6．含量测定
将干燥后RNA产品配制成浓度为 10—50pg／ml的溶液，在751型分光光度
计上测定其260nm处的吸光度，按下式计算RNA含量：
式中，A260为260nm处的吸光度；L为比色杯光径（cm）；0.024为lml溶液含lμg
RNA的吸光度。
五、结果处理
根据含量测定的结果按下式计算提取率
六、注意事项
1．用浓盐法提取RNA时应注意掌握温度，避免在20～27℃之间停留时间过长，因为这是磷酸二酯酶和磷酸单酯酶作用活跃的温度范围，会使RNA降解而降低提取率。
2．加热至90～100℃使蛋白质变性，破坏两类磷酸酯酶，有利于RNA的提取。
**我们实验室一个师兄才做过，效果挺好
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时间：2023-09-26 12:06
苯酚法提取酵母RNA
（一）原理
细胞内大部分RNA 均与蛋白质结合在一起，以核蛋白的形式存在。因此，提取RNA时要把RNA与蛋白质分离并除去。将细胞置于含有十二烷基磺酸钠（Sodium dodecyl sulfate,SDS）的缓冲液中，加等体积水饱和酚，通过剧裂振荡，然后离心形成上层水相和下层酚相。核酸溶于水相，被苯酚变性的蛋白质或者溶于酚相，或者在两相界面处形成凝胶层。
本实验采用的0.15mol/L 缓冲液系统可使大部分RNA-蛋白复合物解离，而DNA-蛋白复合物只有极少部分解离；用酚处理时DNA-蛋白复合物变性，在低温条件下从水相中除去，这样得到的RNA 制品中混杂的DNA 极少。用氯仿-异戊醇继续处理RNA 制品，可进一步除去其中少量的蛋白质。最后用乙醇使RNA 从水溶液中沉淀出来。本法得到的RNA 不仅纯度高，而且多呈自然状态，可供继续研究之用。
（二）主要仪器和试剂
1．仪器
（1）台式高速离心机（10 000r/min）
（2）水浴
（3）Eppendorf 管（1.5mL）
（4）紫外可见分光光度计
（5）冰箱或冷柜（0～4℃）
（6）振荡器
（7）分析天平（精确至0.1mg）
（8）真空干燥器
2．试剂（均为分析纯）
（1）SDS-缓冲液：0.3％ SDS，0.1mol/L NaCl，0.05mol/L 乙酸钠，用乙酸调到pH5.0。
（2）饱和酚液：重蒸苯酚用（1）溶液饱和。
（3）氯仿-异戊醇液：24：1（V/V）。
（4）含2％乙酸钾的95％乙醇溶液。
（5）无水乙醇
（6）乙醚
（7）溶菌酶（B.R.）（1mg/mL）
（三）操作步骤
1．取1g 活性干酵母在研钵中研碎，加10mL SDS-缓冲液使成匀浆，洗入各Eppendorf管（略少于管容积的一半），加溶菌酶0.1mL，混匀，室温静置10min，再加等体积饱和酚液，室温下剧烈振荡5min。置冰浴中分层，在0～4℃低温环境下，10 000r/min 离心10min。吸出上层清液，转入新的Eppendorf 管，加等体积氯仿-异戊醇，室温下剧烈振荡2.5min，然后10 000r/min 离心5min。吸出上层清液，转入另一新Eppendorf 管，加2 倍体积95％乙醇（含2％乙酸钾），在冰浴中放置30min，使RNA 沉淀。再以10 000r/min 离心5min，弃上清液，沉淀用少许无水乙醇和乙醚各洗一次，即加乙醇或乙醚，迅速离心各1min，保留沉淀。倾去乙醚后，减压真空干燥，准确称重，记录。RNA 制品纯度的测定及RNA 提取率的计算与浓盐法相同。
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时间：2023-09-26 12:07
分子克隆技术（华农）
实验一 质粒的制备
质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的主要载体，它在基因操作中具有重要作用。质粒的分离与提取是最常用、最基本的实验技术。
质粒的提取方法很多，大多包括3个主要步骤：细菌的培养、细菌的收集和裂解、质粒DNA的分离和纯化。本实验以碱裂解法为例，介绍质粒的抽提过程。
实验目的：掌握碱裂解法抽提质粒的原理、步骤及各试剂的作用。
实验材料：含有质粒pUC18载体的大肠杆菌菌液，克隆有水稻外源片段的BAC的大肠杆菌菌液。
实验原理：在pH 12.0 ~ 12.6碱性环境中，细菌的线性大分子量染色体DNA变性分开，而共价闭环的质粒DNA虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态。将pH调至中性并有高盐存在及低温的条件下，大部分染色体DNA、大分子量的RNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍然为可溶状态。通过离心，可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，然后用酚、氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。
实验步骤：
1. 取含有pUC18质粒的大肠杆菌菌液于LA培养基上37℃过夜培养；
2. 用无菌牙签挑取单菌落，接种于含有Amp抗生素的LB培养基中，37℃摇床~250 r/min过夜培养；
3. 吸取1.5 ml菌液，12000 g离心2分钟，收集菌体，倒掉菌液；吸取1.5 ml菌液，再次收集菌体，尽量将菌液倒干净；
4. 加入300 ml溶液 I振荡打匀，重新悬浮细胞，震荡混匀（注意：应彻底打匀沉淀或碎块）； （剧烈）
5. 加入300 ml溶液II，轻柔颠倒混匀，放置至清亮，一般不超过5分钟；
6. 加入300 ml溶液III颠倒混匀，放置于冰上10分钟，使杂质充分沉淀；（温和）
7. 12000 g离心10分钟；
8. 吸取800 ml上清液（注意：不要吸取到飘浮的杂质）至另一Eppendorf管中，加入2/3体积的异丙醇，室温下放置5分钟；
9. 12000 g 常温离心15分钟；
10. 倒尽上清，加75％乙醇浸洗除盐（放置片刻或离心3分钟后倒去上清）；
11. 室温放置或超净台上风干DNA；
12. 加40 ml灭菌超纯水或TE溶解；
13. 质粒、BAC的质量检测，于-20℃保存。
附注：质粒检测
电泳检测：质粒电泳一般有三条带，分别为质粒的超螺旋、开环、线型三种构型
吸光值检测：采用分光光度计检测260nm、280nm波长吸光值，若吸光值260nm/280nm的比值介于1.7－1.9之间，说明质粒质量较好，1.8为最佳，低于1.8说明有蛋白质污染，大于1.8说明有RNA污染。
实验二 DNA的琼脂糖凝胶电泳
带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳。电泳的种类多，应用非常广泛，它已成为分子生物学技术中分离生物大分子的重要手段。琼脂糖凝胶电泳由于其操作简单、快速、灵敏等优点，已成为分离和鉴定核酸的常用方法。
实验目的：掌握琼脂糖凝胶电泳的原理，学习琼脂糖凝胶电泳的操作。
实验材料：质粒DNA、BAC、植物总DNA
回答者： caoad007 - 秀才 二级 5-19 12:56
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其他回答 共 3 条
你要干什么.国家实验室的攻关课题你想在网上下啊.没有庞大的金钱和技术支持根本别想触及着方面.
回答者： obaoyu - 魔法师 五级 5-19 10:45
国家实验室的攻关课题？不至于吧，楼上的。我们大学实验就有这个，提取酵母菌的RNA。楼主去买本北大出的《生物化学实验》，李健武著。里边有详细的操作步骤。
先写一个随手搜到的ppt
http://lab.swhospital.com/UploadFiles/2003617151741912.ppt
回答者： kcno - 举人 四级 5-19 10:59
原理没找到，以下是方法和步骤。
总RNA（total RNA）和信使RNA(mRNA)的抽提
1、实验目的
提取人体细胞的总RNA和mRNA。
2、本实验所需试剂
1）、CNE-2细胞及培养细胞的一系列条件，
2）、PBS缓冲液， TRIZOL试剂，
3）、DEPC处理过的水、大、中、小Tip及1.5 ml EP管,
4）、新的氯仿、异丙醇和乙醇，
5）、mRNA分离试剂盒：Oligotex mRNA Mini Kit,Cat.no.:70022, QIAGEN。
6）、新配的电泳缓冲液，专跑RNA的琼脂糖（Agarose）。
3、实验流程(掌握内容)
3.1 细胞总RNA的提取
1）、6孔板细胞（CNE-2）汇合度为90-100%时，取出无菌室，去其上清，用PBS洗两次后，每孔加TRIZOL试剂（Gibco公司） 1 ml，摇匀，无菌罩内消化3-5分钟（观察：液体变粘稠，细胞脱壁）。
2）、将各孔内消化好的细胞裂解液吸到一DEPC处理过的1.5 ml EP管中，加新开的氯仿0.2 ml，轻摇15秒。
3）、室温静置2-3分钟后，12000 rpm，15 min，4℃，离心。然后取上清无色水相（约0.6 ml）到 EP管（DEPC处理过），加0.5 ml新开的异丙醇，室温下静置10分钟。
4）、12000 rpm，10分钟，4℃，离心。观察总RNA在管底的白色沉淀，弃去上清（小心别丢了沉淀），75%乙醇1.0 ml洗涤（用DEPC水新配制）后，7500 rpm，5 min，4℃离心。
5）、去上清，点离，用小Tip吸干液体。气干沉淀5-10分钟， DEPC处理水20-30 ul加入，中*打匀，55-60℃水浴10分钟溶解总RNA，测OD值。
6）、电泳。
3.2 从总RNA中分离mRNA（Oligotex mRNA Mini Kit,Cat.no.:70022, QIAGEN）
1）、取上述提取的总RNA若干（少于0.25 mg）到一个新的无RNase 的EP管中，用无RNase的水定容到250 ul。
2）、加入Buffer OBB 250 ul, Oligotex Suspension 15 ul。用Tip打匀或用手弹匀。
3）、70℃水浴，3分钟（裂解RNA的二级结构）。
4）、20-30℃条件下，静置10分钟（让Oligotex与mRNA结合）。
5）、高速离心2分钟，小心吸走上清（该上清要保留），留下约50 ul的上清在原管里。
6）、用Buffer OW2 400 ul重悬含Oligotex/mRNA复合物的沉淀，然后将这些加到套有1.5 ml EP管的SPIN柱子上，高速离心1分钟。
7）、将SPIN柱子移到一个新的EP管上，加Buffer OW2 400 ul到柱子，高速离心1分钟，丢掉滤过液。
8）、将SPIN柱子移到一个新的EP管上，加20-100 ul热的（70℃）Buffer OEB到柱子上，用Tip来回吸打3-4次，高速离心1分钟。
9）、为保证最大的 mRNA产量，可再次重复第8步。
10）、电泳。
4、mRNA的应用(了解内容)：
RT-PCR, Northern杂交，cDNA文库构建, mRNA末端快速扩增(RACE)，差异表达(DDRT-PCR)，引物延伸反应(Primer Extension)，体外转录(In Vitro RNA Transcription), RNA标记(RNA labeling)，RNA酶保护试验(RNase and S1 Nuclease Protection Assay)，RNA微注射(RNA Microinjection)
动植物组织mRNA提取实验方法
作者：admin 来源：本站原创 2006-1-16
一、材料
水稻叶片或小鼠肝组织。
二、设备
研钵，冷冻台式高速离心机，低温冰箱，冷冻真空干燥器，紫外检测仪，电泳仪，电泳槽。
三、试剂
1、无RNA酶灭菌水：用将高温烘烤的玻璃瓶（180℃ 2小时）装蒸馏水，然后加入0.01%的DEPC（体积/体积），处理过夜后高压灭菌。
2、75%乙醇：用DEPC处理水配制75%乙醇，（用高温灭菌器皿配制），然后装入高温烘烤的玻璃瓶中，存放于低温冰箱。
3、1×层析柱加样缓冲液；20mmol/L Tris·Cl(pH7.6)，0.5mol/L NaCl，1mmol/L EDTA(pH8.0)，0.1% SDS。
4、洗脱缓冲液：10mmol/L Tris·Cl (pH7.6)，1mmol/L EDTA (pH8.0)，0.05% SDS。
四、操作步骤
（一）动植物总RNA提取-Trizol法
Trizol法适用于人类、动物、植物、微生物的组织或培养细菌，样品量从几十毫克至几克。用Trizol法提取的总RNA绝无蛋白和DNA污染。RNA可直接用于Northern斑点分析，斑点杂交， Poly(A)+分离，体外翻译，RNase封阻分析和分子克隆。
1、将组织在液N中磨成粉末后，再以50-100mg组织加入1ml Trizol液研磨，注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%。
2、研磨液室温放置5分钟，然后以每1mlTrizol液加入0.2ml的比例加入氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒。
3、取上层水相于一新的离心管，按每mlTrizol液加0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇，室温放置10分钟，12000g离心10分钟。
4、弃去上清液，按每ml Trizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇，涡旋混匀，4℃下7500g离心5分钟。
5、小心弃去上清液，然后室温或真空干燥5-10分钟，注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度。然后将RNA溶于水中，必要时可55℃-60℃水溶 10分钟。RNA可进行mRNA分离，或贮存于70%乙醇并保存于-70℃。
[注意] 1、整个操作要带口罩及一次性手套，并尽可能在低温下操作。
2、加氯仿前的匀浆液可在-70℃保存一个月以上，RNA沉淀在70%乙醇中可在4℃保存一周，-20℃保存一年。
（二）mRNA提取
由于mRNA末端含有多poly(A)+，当总RNA流径oligo(dT)纤维素时，在高盐缓冲液作用下，mRNA被特异的吸附在oligo(dT)纤维素柱上，在低盐浓度或蒸馏水中，mRNA可被洗下，经过两次oligo(dT) 纤维素柱，可得到较纯的mRNA。
1、用0.1mol/L NaOH悬浮0.5-1.0g oligo(dT)纤维素。
2、将悬浮液装入灭菌的一次性层析柱中或装入填有经DEPC处理并经高压灭菌的玻璃棉的巴斯德吸管中，柱床体积为0.5-1.0ml，用3倍柱床体积的灭菌水冲洗柱床。
3、用1x柱层析加样缓冲液冲洗柱床，直到流出液的pH值小于8.0。
4、将（一）中提取的RNA液于65℃温育5分钟后迅速冷却至室温，加入等体积2x柱层析缓冲液，上样，立即用灭菌试管收集洗出液，当所有RNA溶液进入柱床后，加入1倍柱床体积的1x层析柱加样溶液。
5、测定每一管的OD260，当洗出液中OD为0时，加入2-3倍柱床体积的灭菌洗脱缓冲液，以1/3至1/2柱床体积分管收集洗脱液。
6、测定OD260，合并含有RNA的洗脱组分。
7、加入1/10体积的3M NaAc(pH5.2)， 2.5倍体积的冰冷乙醇， 混匀， -20℃30分钟。
8、4℃下12000g离心15分钟，小心弃去上清液，用70%乙醇洗 涤沉淀，4℃下12000g离心5分钟。
9、小心弃去上清液，沉淀空气干燥10分钟，或真空干燥10分钟。
10、用少量水溶解RNA液，即可用于cDNA合成（或保存在70%乙醇中并贮存于-70℃）。
[注意] 1、mRNA在70%乙醇中-70℃可保存一年以上。
2、oligo(dT)纤维素柱用后可用0.3mol/l NaOH洗净，然后用层析柱加样缓冲液平衡，并加入0.02%叠氮钠（NaN3)冰箱保存，重复使用。每次用前需用NaOH水层析柱加样缓冲液依次淋洗柱床。
你可以看看《分子克隆》书上都有的。
参考资料：http://www.bioon.com/
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时间：2023-09-26 12:08
我本科毕业论文做过酵母RNA的提取，用液氮研磨破壁，用TRI REAGENT对酵母中的总RNA进行提取，这些东西随便找本分子克隆技术的书里面就有，或者上丁香园也可以找到。以下是我的实验步骤，供参考。
TRI REAGENT法提取RNA
1.取菌液20mL，分装于10mL离心管中，平衡后，3500rpm离心5min；
2.倒去上清，PBS洗涤1次，3500rpm离心5min；
3.倒去上清，PBS洗涤1次，4℃，12000rpm离心1min；
4.重复步骤3洗涤1次；
5.倒去上清，将沉淀移如研磨缸中，加入液氮研磨4次；
6.将粉末移入两只新离心管中，分别加入1mL TRI REAGENT试剂，静置5min；
7.加入200mL 氯仿，摇动15s，静置10min；
8.4℃ 12000rpm离心15min，取上清至新离心管中；
9.加入500μL异丙醇，静置8min；
10.4℃ 12000rpm离心15min，吸出上清，加入75%乙醇洗涤3次；
11.加入75%乙醇， -70℃保存。
