蛋白质的分离纯化

蛋白质的分离纯化方法

蛋白质的分离纯化主要包括“前处理”，“粗分级”，“细分级”三个步骤，本文主要讲述“细分级”，即粗提的蛋白质分离纯化的方法。

蛋白质的分离纯化方法根据蛋白质不同的生理特性有不同的方法分类，主要根据以下几个性质来设计纯化方法：

一、 根据分子大小不同分离纯化：

蛋白质是一种大分子物质,并且不同蛋白质的分子大小不同，因此可以利用一些较简单的方法使蛋白质和小分子物质分开，并使蛋白质混合物也得到分离。根据蛋白质分子大小不同进行分离的方法主要有透析、超滤、离心和凝胶过滤等。

1、透析和渗滤：

主要利用半透膜

透析是将待分离的混合物放入半透膜制成的透析袋中，再浸入透析液进行分离。超滤是利用离心力或压力强行使水和其它小分子通过半透膜，而蛋白质被截留在半透膜上的过程。

这两种方法都可以将蛋白质大分子与以无机盐为主的小分子分开。它们经常和盐析、盐溶方法联合使用，在进行盐析或盐溶后可以利用这两种方法除去引入的无机盐。由于超滤过程中，滤膜表面容易被吸附的蛋白质堵塞,以致超滤速度减慢,截流物质的分子量也越来越小。所以在使用超滤方法时要选择合适的滤膜,也可以选择切向流过滤得到更理想的效果。

2、离心

离心也是经常和其它方法联合使用的一种分离蛋白质的方法。当蛋白质和杂质的溶解

度不同时可以利用离心的方法将它们分开。例如，在从大米渣中提取蛋白质的实验中，加入纤维素酶和α-淀粉酶进行预处理后，再用离心的方法将有用物质与分解掉的杂质进行初步分离。

3、凝胶过滤

凝胶过滤也称凝胶渗透层析,是根据蛋白质分子大小不同分离蛋白质最有效的方法之一。

凝胶过滤的原理是当不同蛋白质流经凝胶层析柱时，比凝胶珠孔径大的分子不能进入珠内网状结构,而被排阻在凝胶珠之外，随着溶剂在凝胶珠之间的空隙向下运动并最先流出柱外；反之,比凝胶珠孔径小的分子后流出柱外。目前常用的凝胶有交联葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶等。 二、 根据溶解度不同分离纯化

影响蛋白质溶解度的外部条件有很多，比如溶液的pH值、离子强度、介电常数和温度等。

但在同一条件下，不同的蛋白质因其分子结构的不同而有不同的溶解度,根据蛋白质分子结构的特点,适当地改变外部条件，就可以选择性地控制蛋白质混合物中某一成分的溶解度,达到分离纯化蛋白质的目的。

常用的方法有等电点沉淀和pH值调节、蛋白质的盐溶和盐析、有机溶剂法、双水相萃取法、反胶团萃取法等。

1、等电点沉淀和pH值调节

等电点沉淀和pH值调节是最常用的方法。每种蛋白质都有自己的等电点,而且在等电点时溶解度最低；相反，有些蛋白质在一定pH值时很容易溶解。因而可以通过调节溶液

的pH值来分离纯化蛋白质。

2、蛋白质的盐溶和盐析

蛋白质的盐溶和盐析是中性盐显著影响球状蛋白质溶解度的现象,其中,增加蛋白质溶解度的现象称盐溶,反之为盐析。同样浓度的二价离子中性盐,如MgCl2、(NH4)2SO4对蛋白质溶解度影响的效果,要比一价离子中性盐如NaCl、NH4Cl大得多。

盐析是提取血液中免疫球蛋白的常用方法,如多聚磷酸钠絮凝法、硫酸铵盐析法,其中硫酸铵盐析法广泛应用于生产。由于硫酸铵在水中呈酸性,为防止其对蛋白质的破坏,应用氨水调pH值至中性。为防止不同分子之间产生共沉淀现象,蛋白质样品的含量一般控制在0·2% ~2·0%。利用盐溶和盐析对蛋白质进行提纯后，通常要使用透析或者凝胶过滤的方法除去中性盐。

3、有机溶剂法

原理：与水互溶的有机溶剂(如甲醇、乙醇)能使一些蛋白质在水中的溶解度显著降低；而且在一定温度、pH值和离子强度下，引起蛋白质沉淀的有机溶剂的浓度不同，因此，控制有机溶剂的浓度可以分离纯化蛋白质。

由于在室温下,有机溶剂不仅能引起蛋白质的沉淀,而且伴随着变性。因此，通常要将有机溶剂冷却，然后在不断搅拌下加入有机溶剂防止局部浓度过高,蛋白质变性问题就可以很大程度上得到解决。对于一些和脂质结合比较牢固或分子中极性侧链较多、不溶于水的蛋白质，可以用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂提取，它们有一定的亲水性和较强的亲脂性，是理想的提取液。

冷乙醇分离法提取免疫球蛋白最早由Cohn于1949年提出,用于制备丙种球蛋白。冷乙醇法也是目前WHO规程和中国生物制品规程推荐的方法,不仅分辨率高、提纯效果好、可同时分离多种血浆成分,而且有抑菌、清除和灭病毒的作用。

4、双水相萃取法

双水相萃取技术是指亲水性聚合物水溶液在一定条件下形成双水相，由于被分离物在两相中分配的不同，便可实现分离,被广泛用于生物化学、细胞生物学和生物化工等领域的产品分离和提取。

此方法可以在室温环境下进行，双水相中的聚合物还可以提高蛋白质的稳定性,收率较高。对于细胞内的蛋白质,需要先对细胞进行有效破碎。目的蛋白常分布在上相并得到浓缩,细胞碎片等固体物分布在下相中。采用双水相系统浓缩目的蛋白,受聚合物分子量及浓度、溶液pH值、离子强度、盐类型及浓度的影响。

5、反胶团萃取法

反胶团萃取法是利用反胶团将蛋白质包裹其中而达到提取蛋白质的目的。反胶团是当表面活性剂在非极性有机溶剂溶解时自发聚集而形成的一种纳米尺寸的聚集体。这种方法的优点是萃取过程中蛋白质因位于反胶团的内部而受到反胶团的保护。 三、 根据电荷不同进行分离纯化

根据蛋白质的电荷即酸碱性质不同分离蛋白质的方法有电泳和离子交换层析两类。 1、电泳

在外电场的作用下,带电颗粒(如不处于等电点状态的蛋白质分子)将向着与其电性相反的电极移动,这种现象称为电泳。

聚丙烯酰胺电泳是一种以聚丙烯酰胺为介质的区带电泳,常用于分离蛋白质。它的优点是设备简单、操作方便、样品用量少。等电聚焦是一种高分辨率的蛋白质分离技术,也可以用于蛋白质的等电点测定。利用等电聚焦技术分离蛋白质混合物是在具有pH梯度的介质

中进行的。在外电场作用下各种蛋白质将移向并聚焦在等于其等电点的pH值梯度处形成一个窄条带。

三者区别：聚丙烯酰胺电泳的条带分辨率低,加样量不高;等电聚焦电泳分辨率最高,可以分离同种蛋白的亚成分,加样量最小;等速提纯电泳区带分辨率较高,可将样品分成单一成分,加样量最大

2、离子交换层析

离子交换层析是以离子交换剂为固定相,依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。离子交换层析中,基质由带有电荷的树脂或纤维素组成。带有正电荷的为阴离子交换树脂;反之为阳离子交换树脂。离子交换层析同样可以用于蛋白质的分离纯化。当蛋白质处于不同的pH值条件下,其带电状况也不同。阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质,被留在层析柱上,通过提高洗脱液中的盐浓度,将吸附在层析柱上的蛋白质洗脱下来,其中结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。反之阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质,结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的pH值洗脱下来。 四、 利用对配体的特异亲和力进行分离纯化

1、亲和层析

亲和层析是利用蛋白质分子对其配体分子特有的识别能力(即生物学亲和力)建立起来的一种有效的纯化方法。它通常只需一步处理即可将目的蛋白质从复杂的混合物中分离出来,并且纯度相当高。应用亲和层析须了解纯化物质的结构和生物学特性以便设计出最好的分离条件。

该方法成本较低,吸附剂价格低廉、机械强度高、抗污染能力较强、非特异性吸附较小、

可反复使用、适用性广,产品质量稳定。