人牙周膜成纤维细胞在无血清培养液中的生长特性

牙体牙髓牙周病学杂志２００２年２月第１２卷第２期（总第４８期）　・６８　Ｃｈ／ａｅｓｅ　Ｊｏｕｎａｌ　Ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ　Ｄｅｎｔｉｓｔｒｙ２ＯＯ２　Ｆｅｂ．Ｖｏｌ　１２　Ｎｏ　２　．．人牙周膜成纤维细胞在无血清培养液中的生长特性　张云飞，段银钟，冯雪，刘源，赵宇　（第四军医大学口腔医学院，陕西西安７１００３２）　［摘岍要］　目的：探讨人牙周膜成纤维细胞在无血清培养液中的生长特性。方法：用倒置显微镜和　法观察人牙周膜成纤维细胞在无血清培养液中的生长和增殖变化。结果：人牙周膜成纤维细胞在无血清　培养液条件下可以生长和增殖，但与含血清培养液相比，其增殖速率变缓，分化明显。结论：无血清培养液可应　用于人牙局膜成纤维细胞的体外培养和实验研究中＝　［关键词］人牙周膜成纤维细胞；无血清培养液；体外培养　［中围号］Ｒ７８０．２　［文献标识码］Ａ　［文章编号］１００５—２５９３（２００２）０２—００６８—０４　［牙体牙髓牙周病学杂志，２００２．１２（２）：６８］　Ｇｒｏｗｔｈ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ　ｌｉｇａｍｅｎｔ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ　ｉｎ　ｓｅｒｕｎｌ—－ｆｒｅｅ　ｍｅｄｉＩｌｌｉｌ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　ＺＨＡＮＧ　Ｙｕｎ—ｆｅｉ，ＤＵＡＮ　Ｙｉｎ—ｚｈｏｎｇ，ＦＥＮＧ　Ｘｕｅ，ｅｔ　ａＩ　（Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆＳｔｏｍａＷｌｏｇｙ，Ｔｈｅ　Ｆｏｕｒｔｈ　Ｍｉｌｉｔａ０　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓ姆，　’∽７１００３２，Ｃｈｉｎａ）　［Ａｂｓｔｒａｃｔ］　ｕｍ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｉｎ　Ａｎｌ：Ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｔｈｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ　ｌｉｇａｍｅｎｔ　ｉｆｂｒｏｂｌａｓｔｓ　ｉｎ　ｅｒｓｕｍ—ｆｒｅｅ　ｍｅｄｉ．　ｇｒｏｗｔｈ　ａｎｄ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ　ｌｉｇａｍｅｎｔ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ　ｉｎ　ｒＩｌｍ—　．ＭＥＴＨＯＤＳ：　ｆｒｅｅ　ｍｅｄｉｕｍ　ｗｅｒｅ　ｏｂｓｅｒｖｅｄ　ｕｎｄｅｒ　ｒｅｗｒｓｅ　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ　ａｎｄ　ｕｓｉ￣ｓ　Ｍ＿ｒｒ　ｍｅｔｈｏｄ．ＲＥＳＵＬＴＳ．Ｈｕｍａｎ　ｐｅｒｉｄｏｍａｌｏ　ｌｉｇａｍｅｎｔ　ｉｆｂｒｏｂｌａｓｔｓ　ｃｏｕｌｄ　ｇｒｏｗｔｈ　ａｎｄ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｅ　ｉｎ　ｓｅｎＬｍ～ｆｒｅｅ　ｍｅｄｉｕｍ，ｂｕｌ　ｉｎ　ｅｏｍｐ￣ｉｎｇ　ｗｉｔｈ　ｔｈｏｓｅ　ｉｎ　ｓｅｒｕｍ—ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　ｍｅ．　ｄｉｔｉｍ，ｔｈｅｉｒ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｒａｔｅ　ｄｅｅｒｅａｓｅｄ　ａｎｄ　ｔｈｅｉｒ　ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｂｅｃａｍｅ　ｅａｒｌｉｅｒ．ＣＯＮＣＬＵＳＩＯＮ：Ｓｅｒｕｍ—ｆｒｅｅ　ｍｅｄｉｔｉｍ　￣８１１　ｂｅ　ｕｓｅｄ＿盯ｅｘｐｅ　眦ｎ【ａｌ　ｓｔｕｄｙ　ｆｏｒ　ｃｕｌｌｕｒｅ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｐｅｎｏｄｏｎｌａ］ｌｉａｍｅｎｔｇ　ｆｉｂｒｏｂＪ∞ｔｓ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　［Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ］ｈｕｍａｎ　ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ　ｌｉｇａｍｅｎｔ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ；ｓｅｒｕｍ—ｆｒｅｅ　ｍｅｄｉｕｍ；ｃｕｌｔｕｒｅ　ｉｎ础ｍ　［Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ　Ｄｅｎｔｉｓｔｒｙ＂，２００２，１２（２）：６８一　人牙周膜成纤维细胞（ｈｕｍａｎ　ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ　ｌｉｇａ．　ｍｅｎｔ　ｆｉｂｍｂｌａｓｔｓ，ＨＰＤＬＦ）是口腔医学实验中常用的　从而影响实验结果的准确性　。现已证明：血清　研究对象，国内报道的其体外培养和实验条件都是　采用含血清培养液　“　。血清中含有细胞生长和　增殖所必需的营养成分和生长因子，可以促进体外　培养的细胞贴壁和生长，是体外培养细胞不可缺少　可由已知成分的人工合成培养液添加某些激素、生　长因子和微量元素等代替，称无血清培养液（ｓｅｒｌｌｍ　ｆｒｅｅ　ｍｅｄｉｕｍ．ＳＦＭ）　。在ＨＰＤＬＦ的研究中使　用无血清培养液，可以避免血清中复杂成分的影　响。本研究初步探讨了ＨＰＤＬＦ在无血清培养液中　—的成分。但血清的成分也较复杂，并且尚未完全清　楚，因此，可影响对细胞分泌的微量物质的研究。　同时，血清中还含有一些细胞毒性物质和抑制物　质，对细胞有去分化作用，可影响细胞功能的表达，　的生长特性。　１材料和方法　Ｉ．１材料　收蓿日期：２００１一ｌＯ一１９；幡回日期：２００１—１２—０５　基金瑗目：国家自然科学基金资助项目（３９８０００３３）　用于人二倍体成纤维样细胞体外培养的ＭＣ—　ＤＢ１０５无血清培养液（Ｓｉｇｍａ，美国），ＤＭＥＭ培养　液（Ｇｉｂｃｏ，美国），胎牛血清（ｆｅｔａｌ　ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｌ＇ｕｍ．　ＦＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ．美国），胰蛋白酶（Ｇｉｂｃｏ，美国），　ＭＴＹ（Ｓｉｇｍａ，美国），ＤＭＳＯ（西安化学试剂厂），　作者筒介：张云飞（１９６９一），男，汉族，江苏藉　博士生（导师　段银钟），主治医师　维普资讯 http://www.cqvip.com

牙体牙髓牙周病学杂志２００２年２月第１２卷第２期（总第４８期）　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｊｏｕｎａｌ　ｏｆ　Ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ　Ｄｅｎｔｉｓｔｒｙ－，２００２　Ｆｅｂ．Ｙｏ１．１２　Ｎｏ　２　・６９　ＤＧ３０２２Ａ型酶联免疫检测仪（华东电子管厂），　ＣＯ，孵箱（ＮＵＡＩＲ，ＥＩ本），倒置显徽镜和照相系统　（Ｏｌｙｍｐｕｓ，ＥＩ本）。　１．２方法　纤维细胞生长的影响，选取第５代ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠问　充质成纤维细胞和ＳＤ大鼠皮肤成纤维细胞（均由　第四军医大学口腔医学院病理科提供）与ＨＰＤＬＦ　１．２．１　ＨＰＤＬＦ的原代培养和鉴定　一　选取１１—１４岁青少年因正畸而拔除的新鲜前　磨牙，无菌条件下刮取牙根中１／３的牙周膜组织，　剪成约１ｍｍ　大的小块，平铺于２５ｍｌ的培养瓶底，　加入吉１００　ｍ１／Ｌ　ＦＢＳ的ＤＭＥＭ培养液，放人ＣＯ　孵箱，在３７℃，５０ｍｌ／Ｌ　ＣＯ２，１００％湿度条件下培　进行比较。将第５代ＨＰＤＬＦ、小鼠问充质成纤维　细胞和太鼠皮肤成纤维细胞用２，５ｇ／Ｌ胰酶消化，　调整细胞浓度至２×１０　／ｍｌ，同时接种于３块９６孔　板，每种细胞接种２组，每组６孔，每孔液量２０ＯＩ．ｄ。　先用含１００　ｍｌ／Ｌ　ＦＢＳ的ＤＭＥＭ培养液培养２ａｈ，　待细胞贴壁生长后，实验组更换为ＭＣＤＢ１０５无血　清培养液，对照组为含１００ｍｌ／Ｌ　ＦＢＳ的ＤＭＥＭ培　养液。继续培养２４、４８和７２ｈ后，每孔加ＭＴｒ溶　液２Ｏ　，培养４ｈ．弃去孔内液体，每孔加ＤＭ－　ＳＯ１５０１．ｄ，振荡ｌＯｍｉｎ，ＤＧ３０２２Ａ型酶联免疫检测　仪，测量各孔的Ａ　值。　１．２．４统计学方法　重复测量数据的方差分析，采用ＳＰＳＳ软件。　２结果　２．１形态学观察　养　倒置显微镜下观察细胞生长情况，细胞长满瓶　底８０％时，用２．５ｇ／Ｌ胰蛋白酶消化传代。经ＡＢＣ　法染色，细胞抗波形丝蛋白阳性，抗角蛋白阴性，证　明所培养细胞为成纤维细胞。　１．２．２无血清培养液对ＨＰＤＬＦ生长的影响　将第ｌ代细胞分为４组，分别用４种培养液培　养：①ＭＣＤＢ１０５无血清培养液；②含５０￣ｎｌ／Ｌ　ＦＢＳ　的ＤＭＥＭ培养液：③含１００ｍｌ／Ｌ　ＦＢＳ的ＤＭＥＭ培　养液；④含１５０　ｍｌ／Ｌ　ＦＢＳ的ＤＭＥＭ培养液。将４　组不同培养液培养的第５代ＨＰＤＬＦ用２．５ｇ／Ｌ胰　酶消化，调整细胞浓度至２×１０　／ｍｌ，接种于９６孔　板，每组６孔，每孔液量２００　。同时接种３块９６　倒置显微镜下观察，含血清ＤＭＥＭ培养液组　ＨＰＤＬＦ形态始终呈短梭形（图１）　ＭＣＤＢ１０５无血　清培养液组ＨＰＤＬＦ形态呈长梭形（图２），两组比　较，细胞形态有明显变化。在培养时间上，两组　ＨＰＤＬＦ均可存活较长时间，无明显差别。但无血　清培养液组ＨＰＤＬＦ的细胞形态变得更长（图３）。　孔板，分别用于培养２４、４８和７２ｔｌ。到达培养时间　后，每孔加Ｍ丌溶液２０１￣１，培养４ｈ，弃去孔内液　体，每孔加ＤＭＳＯ　１５０　，振荡］Ｏｍｉｎ，ＤＧ３０２２Ａ型　酶联免疫检测仪，测量各孔的　值。　１．２．３无血清培养液对三种成纤维细胞生长的影响　为了观察ＭＣＤＢ１０５无血清培养液对不同成　传代时接种密度较大时，两组ＨＰＤＬＦ的生长和增　殖很接近。接种密度较小时，无血清培养液组ＨＰ－　ＤＬＦ生长和增殖的速率比含血清培养液组缓慢。　图１含血清培养液组ＨＰＤＬＦ呈短棱　图２无血清培养液组ＨＰＤＬＦ呈长梭　图３　ＨＰＤＬＦ无血清培养４周，细胞形　形（倒置显微镜，１０×）　形（倒置显微镜．１０×）　态更长（倒置显擞镜，１０×）　维普资讯 http://www.cqvip.com

牙体牙髓牙周病学杂志２００２年２月第ｌ２卷第２期（总第４８期）　Ｃｈｉｎｅｓｅ　ｊ∞１１ａｌ　０ｆ　Ｃｏｎｓｅｒ，，ａｆｉｖｅ　Ｄｅｎｔｉｓｔｒｙ．２００２　Ｆｅｂ．Ｖｏ１．１２　Ｎｏ．２　２．２　ＭＴｒ统计结果　无血清培养液组与其它含不同浓度血清培养　液组两两比较差异显著，说明ＨＰＤＬＦ在ＭＣＤＢＩ￣　无血清培养液中的生长和增殖速率要低于含血清　培养液。而ＤＭＥＭ培养液中加入血清的浓度在５Ｏ　一２．２．１无血清培养液对ＨＰＤＬＦ生长的影响（表１）　表１　不同培养液对人牙周膜成纤维细胞　生长的影响　（Ａ值．　±　）　１５０ｍｌ／Ｌ范围内时，对ＨＰＤＬＦ生长和增殖的影　响不显著。从不同时间点的比较来看，ＨＰＤＬＦ在　ＭＣＤＢ１０５无血清培养液中的生长和增殖规律与含　无血清培养｝瞳组与古血清培养｝瞳组两两比较　Ｐ（０　Ｏｌ　血清培养液相同　２．２．２无血清培养液对三种成纤维细胞生长的影　响（表２）　（Ａ值．　±　）　古不同维度血清柏三组培养藏两两比较．Ｐ＞０　０５　各蛆在　同时间点两两　Ｅ较：１ｄ　２ｄ．１ｄ　３ｄ，Ｐ（０　０１；２ｄ　ｍ　３ｄ，Ｐ（０　０５　表２无血清培养液和含血清培养液对三种成纤维细胞生长的影响　与古血清培养液组比较，Ｐ＜０　Ｏｌ｛三十细胞组之间两两比较．Ｐ（０　Ｏ１；不同时间点之间两两比较　Ｐ（０．０５　三种成纤维细胞在无血清培养液以及含　需要改进后利用，这正是本研究的目的。通过观察　１００ｍＬ／Ｌ　ＦＢＳ的ＤＭＥＭ培养液中的生长和增殖均有　ＨＰＤＬＦ在ＭＣＤＢＩ￣无血清培养液条件下的生长特　发现ＨＰＤＬＦ在无血清培养液条件下能够生长和　显著性差异，而且ＨＰＤＬＦ在ＭＣＤＢ１０５无血清培养　性，液和含血清ＤＭＥＭ培养液中的生长和增殖速率都大　增殖，并可以长期存活，但细胞的形态与含血清培养　是细胞分化的表现。另外　于其它两种成纤维细胞。但从不同时间点的比较来　液条件下相比明显变长，无血清培养液条件下ＨＰＤＬＦ的生长和增　看，三种成纤维细胞在无血清培养液和含血清　还观察到，殖与接种密度相关，较低的接种密度对于ＨＰＤＬＦ的　ＤＭＥＭ培养液中的生长规律相同　３讨论　无血清培养影响显著。本实验ＭＴｒ统计学分析结　果显示，ＨＰＤＬＦ在无血清培养液条件下的生长和增　但生长规律与含血清培养液条件　Ｓａｔｏ和Ｈａｙａｓｈｉ　于１９７６年首创无血清培养方　殖速率明显变缓，法，他们用已知的激素、生长因子和微量元素取代血　下相同。根据本实验结果，作者认为在ＨＰＤＬＦ的原　代培养和传代时应使用含血清培养液，在进行ＨＰ—　清。在已知的和限定的条件下，研究细胞生长的各　ＤＬＦ的生物学特性和外加因子的研究时应使用无血　种因素。无血清培养的优点是成分明确。目前，无　清培养液。本实验结果还显示，三种不同成纤维细　血清培养已广泛用于组织器官和细胞的体外培养和　胞在无血清培养液和含血清ＤＭＥＭ培养液中的生长　实验研究中，但在国内的口腔医学领域，这方面的报　特性虽然相同，但它们的生长和增殖速率又有明显　道很少。国外曾报道过专用于人牙周膜细胞的无血　差别，提示虽然培养液的基本成分有近似性，但是不　清培养液（１９９７）Ｄ１］，但国内在人牙周膜细胞的实验　同种类成纤维细胞在体外培养时应选择最适合所培　研究中，大多使用含血清的ＤＭＥＭ或　—ＭＥＭ培养　养细胞生长的培养液。　液，由于无法避免血清中复杂成分的干扰，不能排除　未知因素的作用，而影响到实验结果的准确分析　国外的同类实验中，尤其是进行外加因子的研究时，　目前在体外培养细胞的研究中，含血清培养液　的作用是无法替代的，而无血清培养液的有条件使　用也是必要的，它的最大优点就是成分明确，是用作　多是在无血清培养液条件下进行的，这样可以避免　单因子分析实验的理想条件　本实验为无血清培养　血清中未知成分的影响。本实验中使用的ＭＣ—　液应用于ＨＰＤＬＦ的研究提供了一些依据。　ＤＢ１０５无血清培养液主要用于人二倍体成纤维样细　　胞的体外培养和维持细胞的长期存活，从理论上应　参考文献：该适用于ＨＰＤＬＦ，但需要验证，是可以直接使用还是　［１　岳玲，肖明振，牛忠英ＩＬ一６对人牙髓细胞牙周膜细胞生长影　维普资讯 http://www.cqvip.com

牙体牙髓牙周病学杂志２００２年２月第１２卷第２期（总第４８期）　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｊｏｕｎａｌ　０ｆ　Ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ　Ｄｅｎｎ　ｒｙ，２ＯＯ２　Ｆｅｂ．Ｖｏｌ　１２　Ｎｏ　２　’７１　通处，以氧化锌丁香油水门汀暂封１周。复诊时如无症状　则去除封料．重新冲洗清理根管及穿通处，于髓室内放置抗　生素糊剂，覆盖根管口及穿通处，磷酸锌水门汀垫底，银汞　舍金充填。对于根髓仍有活力者，可于局麻下或失话后去　抗生素糊剂治疗乳磨牙髓底穿通　髓。失活方法为：先用氧化锌丁香油水门汀封住髓底穿通　处，然后于各根管口处放少量乳牙失活剂，用氧化锌丁香油　刘中文。，张力　，方军　，扬富生　水门汀暂封５～７ｄ，复诊时再去髓。去髓后步骤同前。　（１．８９９５２部队门诊部，四川绵阳６２１０００；　１　４注意事项　２．建材医院，陕西西安７１００３２；　①急性期应彻底开放；②常规拍Ｘ线片．观察尖周、髓　３．第四军医大学口腔医学院，陕西西安７１００３２）　室底穿通情况、骨质密度和相应恒牙胚发育情况；③患牙降　黯，以免折裂：　［关键词］抗生素糊剂；乳牙　髓底穿通　１．５评定标准　［中图号］Ｐ，．７８３．１　Ｐ，．７８８　１　［文献标识码］Ｄ　成功：无自觉症状，咀嚼功能良好，无叩痛，无窦道，ｘ　［文章编号］１００５—２５９３（２００２）０２　００７ｌ一０ｌ　线片示尖周及根分叉处无骨质稀疏区。　进步：Ｘ线片示尖周及根分叉原有稀疏区已显著缩小，　临床上困龋坏、操作不当或生理性吸收等原因造成乳　其余与成功者相同。　磨牙髓底穿通者较常见，保存此类乳牙至恒牙正常替换很　无变化：ｘ线片示根尖及根分叉稀疏区无变化。　重要。作者采用空管糊剂治疗，取得良好效果，报道如下。　失败：有自觉症状，咀嚼功能不良，有叩痛，牙松动Ⅱ度　或有窦道形成。Ｘ线片示尖周及根分叉稀疏区明显扩大。　ｔ材料和方法　２结果　１　１临床资料　选择临床乳磨牙髓底穿通患儿２８例２８牙．年龄６—１Ｏ　经过半年的临床观察，２８个患牙中．２４牙成功，占　岁．其中男１８例．女１Ｏ例；急性炎症期９倒，慢性炎症期ｌ９　８６％，４牙进步，占１４％。　例　继承恒牙根长均未超过１／２。　３讨论　１．２糊剂配方　粉：甲硝唑０．１ｇ，氟哌酸０　ｌｇ，氧化锌０．１ｇ．地塞米松　对乳牙病的治疗应尽量保留患牙至替牙期。奉法用空　０　７５ｍｇ。　管糊剂克填根管并置于髓底穿通处。阻断了感染通路，且　液：木榴油。　糊剂有持续的消炎作用，使根分叉牙周组织在控制炎症的　用时将粉加入适量液体诃成糊剂即可。　基础上得以重建，延长了乳牙的保留时间：现在的抗生素　１　３方法　糊剂较多，但多含有磺胺、青霉素等，易致过敏，本糊剂无此　急性期彻底开放引流，去腐质拔除坏死的根髓．３０ｍ！／Ｌ　顾虑。另外，患牙有窦道者只要不是急性溢脓期，均可用本　过氧化氢液和生理盐水反复冲洗，干燥后置丁香油棉球开　糊剂封药，疗效肯定。　放２—３ｄ。复诊时，仍以３０ｍ￣Ｌ过氧化氢液和生理盐水反　（收稿日期：２０００—１２—１５）　复冲洗．干燥后以抗生素糊剂充填根管并覆盖根管口及穿