反胶团萃取技术的研究及进展

摘要：反胶团萃取是近年发展起来的分离和纯化生化物质的新方法,本文介绍了反胶团萃取蛋白质技术的原理和机制、影响反胶团中蛋白质稳定性的因素、在提取分离蛋白质领域的应用以及反胶团萃取技术的研究展望。关键词：反胶团萃取；研究进展；分离技术传统的液-液萃取分离技术具有操作连续,多级分离,放大容易和便于控制等优点,已广泛用于多组分物质的分离。但是生物产品的分离与一般的化工产品不同,它既要求有较高的提取率,又要求较高的活性保持率。近年来,可以选择性的分离特定生物活性分子的反胶团溶液萃取分离技术,逐渐引起了人们的重视。1977年,瑞士的Luisi等人首先发现胰凝乳蛋白酶可以溶解于含有表面活性剂的有机溶剂中,并首次提出了用反胶团萃取蛋白质的概念。这种萃取技术具有成本低,选择性好，分离效率高、速度快、条件温和，能使生物物质保持较高的活性收率，易放大，正萃和反萃同时进行等优良特性。当然，也解决了一个重要问题，比如传统的液-液萃取分离技术很难用于具有某些特殊性质的生化产品(如蛋白质、氨基酸等)的提取与分离，原因在于这类物质多数不溶于非极性有机溶剂，或与有机溶剂接触后会引起变性和失活。而反胶团萃取技术解决了这一难题。反胶团萃取技术是在20世纪80年代中期发展起来的。所谓反胶团，是指当油相中表面活性剂的浓度超过临界胶束浓度后，其分子在非极性溶剂中自发形成的亲水基向内、疏水基向外的具有极性内核(polarcore)的多分子聚集体(aggregates)。反胶团的极性内核可以溶解某些极性物质，而且在此基础上还可以溶解一些原来不能溶解的物质，即所谓二次加溶原理。例如，反胶团的极性内核在溶解了水后，在内核中形成“水池”(waterpoo1)，可以进一步溶解蛋白质、核酸和氨基酸等生物活性物质。胶团的屏蔽作用，使这些生物物质不与有机溶剂直接接触，而水池的微环境又保护了生物物质的活性，从而达到了溶解和分离生物物质的目的[1]。这种技术既利用了溶剂萃取的优点，又实现了生物物质的有效分离，作为一种新型的生物分离技术应用于蛋白质、氨基酸及药物、农药等物质的分离分析中，显示了巨大的应用潜力。经过二十多年的研究发展，目前已广泛应用于蛋白质的分离和纯化,并逐渐延伸至其他生物工程产品,如氨基酸、抗生素、核酸等的分离，研究结果显示出反胶团萃取技术具有良好的应用前景。1反胶团萃取技术的概述1.1反胶团形成与萃取原理反胶团(ReversedMicelles)是是指向非极性溶剂中加入表面活性剂时，当表面活性剂的浓度超过临界胶团浓度时，会在非极性溶剂内自发形成亲水头部向内、疏水尾部向外的具有极性内核的表面活性剂聚集体，具有热力学稳定的有序结构。通常反胶团的极性内核在溶解了水后在内核中形成“微水相”或“水池”，可以进一步溶解蛋白质、核酸、氨基酸等亲水性的生物大分子。胶团的屏蔽作用使这些物质不与有机溶剂直接接触，而“水池”的微环境又保护了生物物质的活性，从而达到了溶解和分离浓缩生物物质的目的[2]。反胶团萃取一般采用离子型表面活性剂制备反胶团相，因此这些表面活性剂所形成的反胶团内表面带有负电荷或正电荷。当改变水相pH值可使蛋白质表面带正电荷(pHpI)，通过与表面活性剂发生强烈的静电相互作用，使蛋白质溶解在反胶团中。理论上，当溶质所带电荷与表面活性剂相反时，由于静电引力的作用，溶质易溶于反胶团，静电引力越大溶解率或分配系数较大，反之，则不能溶解到反胶团相中。反胶团结构的大小取决于“水池”中的含池”中的含水量W0。W0是“水池”中溶入的水与表面活性剂的摩尔比。在W0<10时，水分子被团缚在反胶团的壁上,它的凝固点下降、共价键参数改变、氢键破坏；只有在W0较大时,才存在自由水。含反胶团的有机溶剂与蛋白质水溶液接触时,反胶团依靠静电作用、范德华力、氢键作用等使蛋白质进入“水池”中。2影响反胶团萃取的因素2.1水相pH值的影响表面活性剂的极性头朝向反胶团的内部，使反胶团的内壁带有一定的电荷，而蛋白质是一种两性电解质，通过改变水相pH值可改变蛋白质的表面电荷。当蛋白质所带电荷与反胶团内所带电荷的性质相反时，由于静电引力，可使蛋白质转移到反胶团中。通过改变水相pH，由于静电斥力，可使蛋白质从反胶团相反萃取到水相中。例如：当用阴离子表面活性剂AOT构成反胶团时，其内壁带负电荷，若水相的pH值低于蛋白质的等电点pI，则蛋白质带正电荷，在静电引力的作用下，使蛋白质进人反胶团而实现了萃取。相反，当pH高于pI时，由于静电斥力，使溶入反胶团的蛋白质反向萃取出来，实现了蛋白质的反萃。若使用的是阳离子表面活性剂，则情况与上相反。因此，水相的pH值是影响反胶团萃取蛋白质的最重要因素。[2]

刘海远等在利用AOT反胶团萃取大豆蛋白的过程中分析得出，萃取体系pH在5.5~6.5时，蛋白质的萃取率增加；pH在6.5~8.5时，蛋白质的萃取率下降，在pH为6.5时，蛋白[3]

质萃取率为最大。庹浔等在CTAB-己醇-辛烷体系分离纯化醇脱氢酶的反萃取研究中分析得出，CTAB是阳离子表面活性剂,水相溶液的pH值需高于蛋白质的pI值(ADH的pI=5.4),反胶团萃取才能进行,但若pH值过高则会使ADH变性,实验得出初始水相pH为7.8时,ADH的萃取率最大。2．2水相离子强度的影响研究发现改变反离子种类对反胶团体系的蛋白萃取率影响显著。反离子种类对萃取率的影响是由于它使反胶团的大小发生了变化。离子的水合半径越大,它从带电的胶团内表面附近被体积排斥出去的效应就越显著,进而削弱了横向表面活性剂极性头之间排斥力的屏蔽,导致形成较大的反胶团。改变离子种类及改变离子强度会使蛋白质分子的溶解性下降，甚至使已溶解的蛋白质从反胶团中反萃取出来。[4]

柳畅先等利用反胶团萃取醇脱氢酶，研究表明当离子强度增大时,反胶团内表面的双电层变薄,减弱了蛋白质与反胶团表面之间的静电吸引,从而减少了蛋白质的溶解度,也减弱了表面活性剂极性基团之间的斥力,使反胶团变小,蛋白质不能进入其中，当盐浓度为零时,萃取率在90%以上,随着盐浓度逐渐增加,萃取率不断下降,直至为零。2.3表面活性剂、助表面活性剂的影响常用的形成反胶团的表面活性剂有:二(2-乙基已基)丁二酸磺酸钠(AOT)、Tween类非离子表面活性剂、山梨糖醇酯类(Span)、各种聚氧乙烯类表面活性剂、烷基三甲基卤化铵和磷脂类等。表面活性剂的种类决定其能否形成反胶团，以及反胶团粒径大小，因而决定能否有效地溶解蛋白质。表面活性剂种类、化学组成以及浓度都会影响到萃取效率和生物物质[5]

的活性。蔡海燕等人研究表明，生姜蛋白酶的pI=5.4~5.5,在pH5.4以上,用AOT-异辛烷反胶团不能萃取出生姜蛋白酶,但是却可以萃取出71.86%的杂蛋白。用CTAB庚烷/辛醇反胶团二次萃取AOT-异辛烷萃余液,其蛋白质萃取率为60.25%,萃取液中生姜蛋白酶理论比活力达到49.77(μgPro/μgPro·min-1)。由于常用的几种表面活性都有其各自的局限性，已不能满足发展的需要，所以研究开发廉价、高效、无毒的生物表面活性剂是未来的发展趋势。蛋白质的分子量往往很大，超过几万或几十万，使表面活性剂形成的反胶团的大小不足以包容大的蛋白质，而无法实现萃取，此时加入一些助表面活性剂，使它们插入反胶团结构中，能提高生物催化反应的活性和稳定性。Koichiro等[7]采用AOT-TOA混合反胶团萃取溶菌素酶和牛血清蛋白（BSA）的研究。AOT/TOA体系与酸性原料液混合时，TOA与H+结合形成阳离子铵盐，铵盐能和极性头带负电的AOT作用形成复合物，从而改变反胶团的性能。2.4温度影响温度对反胶团的生物催化反应的影响同对其他溶液一样。当温度升高到一定时,反应活性达到最大。KazumitsuNaoe等人的研究表明:在DK-F-110体系中,40℃时脂肪酶的反应活性最大,随温度升高,脂肪酶活性降低。大部分生物物质的活性对温度变化较为敏感，在一定范围内升高温度会提高产品活性收率，但当温度继续升高，生物物质活性收率将会降低。3反胶团萃取技术的应用范围3.1反胶团萃取技术在提取分离蛋白质领域的应用3.1.1分离蛋白质混合物分子质量相近的蛋白质,等电点或其他因素的不同会引起溶解度的差别,从而可利用[6]

反胶团溶液的选择性予以分离。段海霞等人选择琥珀酸二（2-乙基己基）酯磺酸钠AOT-异辛烷反胶团萃取体系,研究了β-乳球蛋白单一蛋白体系中以及β-乳球蛋白与免疫球蛋白(1:1)混合物体系中蛋白质的分布特性,探讨AOT-异辛烷反胶团体系分离分级乳蛋白的机理。实验条件下,β-乳球蛋白在单一蛋白或混合蛋白体系中的反胶团萃取率均随着水相pH值增加而降低,随水相[Na+]升高而逐渐增加，随水相起始蛋白质量浓度增加而降低，若体系中共存的IgG可明显促进β-乳球蛋白在反胶团中的增溶,在混合蛋白质体系中,β-乳球蛋白与IgG可分别趋于富集在有机相和水相,显示出AOT-异辛烷反胶团体系在牛初乳乳清蛋白分级分离方面具有应用潜力。3.1.2纯化蛋白质[7]

反胶团萃取完成了萃取、反萃取以及纯化过程的有效耦合。王娟等用AOT/异辛烷反胶团萃取转谷氨酰胺酶（MTGase），在适合的萃取条件下与粗酶液相比较，纯化了8.875倍；冷冻、干燥、脱盐、反萃取液，获得MTGase冻干粉，与粗酶液相比较，纯化了689.4[8]

倍。丁晧等人在利用反胶团水合萃取藻蓝蛋白的研究中表明：水合萃取的本质是在调节反胶团体系含水量W0,从而使藻蓝蛋白从反胶团体系中析出。初始具有大量的水有利于水合物生成前反胶团体系能溶解更多的藻蓝蛋白,从而能有效提高藻蓝蛋白的萃取率。3.2反胶团-超临界CO2萃取超临界流体是状态超过气液共存时的最高压力和最高温度下物质特有的点—临界点后的流体,CO2是超临界流体萃取中应用较广泛的流体,但CO2对于亲水性分子、相对分子质量高的物质如氨基酸,蛋白质和许多聚合物以及金属离子的溶解能力非常低。一种使得CO2能够适合溶解这些分子的方法就是采用表面活性剂创造反胶团或微乳液环境。Hutton等用乙醇或戊醇作为助表面活性剂,使AOT成功溶于超临界CO2形成反胶团乳液,该乳液可以萃取甲基橙。用戊醇作助表面活性剂,水/AOT/超临界CO2反胶团乳液在175×105Pa、40℃可以萃取核黄素。3.3在药物中的应用反胶团萃取在药物方面的应用主要集中在各种蛋白、抗体、抗生素的萃取上。美国的Hu等用NaDEHP(二-2-乙基己基磷酸钠)/异辛烷反胶团萃取系统对氨基糖苷类抗生素的反胶团萃取,一步萃取率可达80%以上，但在反萃过程中,由于二价阳离子破坏反胶团体系,萃取到反胶团相中的抗生素重新释放回到水相中。Su等用AOT/异辛烷体系从初乳乳浆中分离免疫球蛋白-G(IgG),反胶团相中提取其他蛋白,水相中得到的IgG纯度达90%以上；Fadnavis等用AOT/异辛烷体系从发酵液中萃取多种抗生素,如红霉素、土霉素、青霉素及[9]

放线菌酮,收率较高。我国吴子生等报道了反胶团相转移法提取青霉素G的研究，青霉素G收率达到90%以上，并保持了活性。有关的报道均表明,反胶团用于抗生素的分离提取是可行的，但离子型表面活性剂的毒性限制了该技术在下游工程中的应用。3.4反胶团萃取技术在日化行业的应用反胶团萃取技术在日化行业中,可用于一些化妆品原料及功能性添加剂如植物油、氨基酸及维生素等的提取。用反胶团萃取可以将氨基酸从发酵液中提取出来。氨基酸的结构和其离子化状态决定了反胶团体系内的相互作用和氨基酸溶解。氨基酸可以通过静电或疏水作用增溶于反胶团中。[10]

利用氨基酸与反胶团作用的差异,可以选择性地分离某些氨基酸。翁连进等人已成功开发了从胱氨酸母液中提取精氨酸的工艺,可以使反胶团中精氨酸的纯度大于98%,整个工艺精氨酸的回收率大于98%。Cardoso等采用三辛基甲基氯化铵(TOMAC)/己醇/正庚烷反胶团体系对天冬氨酸、苯丙氨酸和色氨酸的萃取条件进行了研究。结果表明,即使等电点十分相近的苯丙氨酸和色氨酸也可以完全分离。4展望反胶团具有许多优良特性,较少使用毒性试剂，对人体无害，提取成本低，而且反胶团溶液可反复利用，还可提高目标物的萃取率及分离的选择性。近年来,反胶团萃取技术的理论和应用研究都取得了较大进展，在生化、食品、药物、农业、化工、材料、环保等领域的应用进行了大量的研究和开发。但反胶团萃取技术还是相对较新的领域，有待进一步研究探讨。而且由于表面活性剂的合成费用高,开发廉价、高效、低毒的生物表面活性剂是未来的发展趋势。随着研究的深人,反胶团技术将在工业化大生产方面具有较大的应用潜力。参考文献[1]彭运平,何小维,吴军林.生物物质的分离新技术--反胶团萃取[J].生命的化学,2003,23(4):311-313.[2]刘海远,布冠好,陈复生,等.AOT反胶团体系萃取大豆蛋白质的研究[J].食品科技,2012,37(4):147-154.[3]庹浔,陈樱一,柳畅先.CTAB-己醇-辛烷体系分离纯化醇脱氢酶的反萃研究[J].2008,20(6):675-677.[4]柳畅先,王永美,孙小梅.反胶团萃取醇脱氢酶的研究[J].分析科学学报.2006,22(2):38-41.[5]蔡海燕,周小华.生姜蛋白酶提取及反胶团纯化工艺初步研究[J].天然产物研究与开发.2004,16(6):543-551.[6]段海霞,曹劲松,彭志英.β-乳球蛋白-IgG混合物的反胶团萃取平衡及其机理探讨.中国乳品工业.2005,33(5):8-11.[7]王娟,周小华,骆辉.微生物转谷氨酰胺酶(MTGase)的AOT反胶团纯化研究.天然产物研究与开发.2007,19:396-400.[8]丁晧,裘俊红.反胶团水合萃取藻蓝蛋白研究.浙江工业大学学报,2011,29(4):372-402.[9]吴子生,贾颖萍,褚莹,等.反胶团相转移法提取青霉素G的研究[J].高等学校化学学报,1993,14(10):1427~1431.[10]翁连进,王士斌,蔡晓1混合氨基酸的分离[J].化工进展,2000(2):51-52.