酒精发酵实验

酒精发酵实验方案 一、实验目的

1.掌握酵母菌的筛选方法

2.复习用显微镜观察菌形态的操作步骤

3.掌握酵母生产性能的测定：酵母凝聚性的测定、酵母发酵力的测定、酵母产酒精能力的测定、及其乃酒精的能力、

4.掌握用 DNS 法测定还原糖及其酒精生产中糖化型淀粉酶的酶活力

5.学习酒精出酒率的计算 二、实验器材

1．实验器材恒温培养箱，高压灭菌锅，三角瓶，电磁炉，水浴锅，微波炉，移液枪，枪头，容量瓶，冷凝管，蒸馏烧瓶，铁架台，软管，连通器，天平，酒精计，超净工作台，摇床，试管，紫外分光光度仪，培养皿，玻璃棒，涂布棒，离心管，离心机，漏斗，滤纸，玻璃珠， pH 试纸 2．试剂及药品碘液，20%盐酸溶液，20%氢氧化钠溶液，500?g/ml 标准葡萄糖溶液，玉米粉，糖化酶，马铃薯，酒糟，无水乙醇，蒸馏水，DNS 试剂，可溶性淀粉，葡萄糖 3．实验材料番茄 4．实验培养基 PDA 马铃薯蔗糖（或葡糖糖）琼脂水 PH 200g 20g 15-20g 1000ml 自然马铃薯去皮，切成块煮沸半小时，用纱布过滤，在加糖和琼脂，定容至 1000ml。121℃灭菌 30min。 DNS 试剂酒石酸钾钠 18.2g，溶于 50ml 蒸馏水中，加热，于热溶液中依次加入 3，5二硝基水杨酸 0.03g，NaOH2.1g，苯酚 0.5g，搅拌至溶，冷却后用蒸馏水定容至 100ml 发酵工艺（技术路线）

三、实验步骤

（一）酵母菌种的驯化筛选 1. 酵母菌种的筛选分离筛选采用平板涂布法和划线法。将榨取的番茄汁稀释到 10-3、10-4、10-5 后在 PDA 培养基平板上涂布，后置于28℃隔水式恒温培养箱中静止培养 3 d；从分离得到的酵母菌落中挑取一环酵母菌在 PDA 平板上划线，后

置于28℃隔水式恒温培养箱中静止培养 2 d。

2. 酒精发酵液的微生物检查 1）酵母形态的观察用美蓝染色法取对数生长期的菌体进行制片，在放大 10 倍及 40 倍的显微镜下观察酵母形态，用测微尺测量酵母细胞的大小，并进行死活鉴别。

（二）测定指标及其方法

1. 酵母生产性能鉴定 (1) 酵母菌产酒精能力（发酵力）的测定本实验主要采取称重法与测放出的 CO2 量等测定酵母的发酵力。称重法: 我们将不同酵母菌产酒精能力的测定和酒精发酵合在一起。

2.操作：①糊化：将 625mL 水加到糖化锅中，按照料水比 1：5 称取玉米粉 125g，在电炉上加热并搅拌，调节 pH5.5～6.0，观察现象，记录下黏度迅速增加时的温度。②糖化：待醪液冷却到60℃，调节 pH 值至 4.0－4.5，用移液枪（按 0.6～0.8%/g 淀粉）量取糖化酶加入糖化锅中，搅拌均匀，放入水浴锅中，保持温度为60℃，维持约 10h，用碘液测定糖化液是否含还有淀粉，若未完全则继续糖化直至完全为止。注意开始时液面位置并随时补足由于水的蒸发造成的液面降低。③糖化结束后将糖液 pH 值调至 5.0 左右。④取一些糖化好的糖化液，测定其还原糖的含量（用 DNS 法测定）。⑤将糖化好的糖化液分装 5 个 250 毫升的三角瓶（每个约 150 毫升），接种培养 24 小时的酵母菌，接种量为发酵液的 10%（约 15 毫升）。⑥用干布将三角瓶各部分擦干净，称量初始发酵液的重量，将发酵液放于 28-30℃ 的培养箱中发酵，并于以后每天称量一次，直至重量减至恒重为止。 (2) 酵母菌耐酒精能力的测定：将产酒精能力最强的菌体用去离子水洗涤 2 次，后于30℃和不同的酒精浓度（0%、3%、6%、9%、12%、15%、18%）条件下进行试验，定期取样检测活细胞目：菌体的耐酒精能力以酵母细胞增长数表示，酵母细胞增长数 (％)=(C1-C0／

t)×100％， 1 和 C0 分别表示发酵时间为 t 小时的细胞数和刚开始 C 时的细胞数，以表示酵母菌在不同的酒精浓度下的耐酒精能力，连续观察 5 天。 (3)酵母凝聚性的测定本实验采用本斯值法。将酵母茵在30℃度摇床中摇瓶培养 36 h，离心弃上清液，经无菌水洗涤 3 次后，称重 1 g 酵母菌泥于刻度 15 mL 的离心管中，注入 10 mL pH 值

为 4.5 的醋酸盐缓冲液，20℃水浴中放置 20 min 后，摇动离心管 5 min 使酵母细胞重新均匀悬浮，静置，记录 i0 min 时酵母细胞沉淀的毫升数，即为本斯值。根据本斯值判断酵母菌株的凝聚性强弱。

（三）发酵前后发酵液中还原糖含量的测定（DNS 法）发酵前后发酵液中还原糖含量的测定（酵液中还原糖含量的测定本实验采用 DNS 法，利用可见光分光光度计，在 540 nm 波长下进行比色测定，测定酒样的光密度值，确定番茄酒中总糖含量，操作简捷，杂质干扰少。酶活的定义：1 mL 酶液于上述条件下，1min 内产生 1?mol 葡萄糖量的酶量定义为 1 个酶活力单位“IU”。 1）标准曲线的绘制本实验采用3， 5-二硝基水杨酸比色定糖法(DNS)。测定酶解液中还原糖含量，按表1进行葡萄糖标准曲线溶液配置，用分光光度计

540 nm下进行比色测定，用空白管溶液调零后，测定各管光密度值，以葡萄糖浓度为横坐标，光密度值为纵坐标，绘制标准曲线，用回归方程计算出相应的葡萄糖含量。表1 葡萄糖标准曲线溶液配置表 Table1 Preparation of solution for glucose standard curve 项目空白 0 0 2.0 1.5 1 0.2 0.2 1.8 1.5 2 0.4 0.4 1.6 1.5 3 0.6 0.6 1.4 1.5 4 0.8

0.8 1.2 1.5 5 1.0 1.0 1.0 1.5 6 1.2 1.2 0.8 1.5 7 1.4 1.4 0.6 1.5 8 1.6 1 .6 0.4

1.5 含糖总量(mg) 葡萄糖液(mL) 蒸馏水(mL) DNS 试剂(mL) 加热冷却蒸馏水定容沸水浴加热10 min 立即用流水冷却定容至25 mL 2）发酵前后发酵液中还原糖含量的测定取5ml 糖化液进行过滤，滤液用 pH4.6 的醋酸盐缓冲液进行稀释，大约稀释 10 倍。取甲、乙两支试管，甲试管加入 1ml 稀释的糖化液，乙管加入 1mlpH4.6 的缓冲液，分别加入2mlpH4.6 的醋酸盐缓冲液和 2mlDNS 试剂。混匀后沸水浴加热 5min，立即冷却定容到

5ml。混匀分别于 540nm 处比色，用乙管调零，测 3 次，记录光密度值。然后在标准曲线上查得相应的还原糖含量 G mg。再由下式计算样品中还原糖的含量：还原糖含量(mg／mL)= Ga 式中： a 一稀释倍数 G 一还原糖量(mg)

（四）酒精生产中糖化型淀粉酶的酶活力测定原理：原理：糖化型淀粉酶是一类酶的总称。共同特点是可以将淀粉水解成麦芽糖或葡萄糖，包括淀粉-1，4-麦芽糖苷酶（β-淀粉酶）、淀粉-1，4-葡萄糖糖苷酶（糖化酶）和淀粉-1， 6-葡萄糖苷酶（异淀粉酶）本实验的研究对象是淀粉α-1，。 4-葡萄糖苷酶，它有催化淀粉水解的作用，从淀粉分子非还原性末端开始，分解α-1，4-糖苷键生成葡萄糖，反应生成的葡萄糖用碘量法定量测定，以表示糖化性淀粉酶的活力。碘量法原理：碘量法原理：淀粉经糖化酶水解生成葡萄糖，葡萄糖具有还原性，其羰基易被弱氧化剂次碘酸盐所氧化。I2+2NaOH→NaIO+NaI+H2O

NaIO+CH2OH(CHOH)4CHO→CH2OH(CHOH)4COOH+ NaI 体系中加入过量的碘，氧化反应完成用硫代硫酸钠标准溶液滴定过量的碘，则可计算出酶的活力。I2+2Na2S2O3→Na2S4O6+2NaI 仪器：仪器：吸管（25ml、10ml、5ml、2ml）定碘瓶；碱式滴定管；恒温水浴锅；分析天平。试剂：试剂：（1）2%可溶性淀粉称取可溶性淀粉 2g（预先100℃烘干约 2h 至恒重），用少量蒸馏水调匀，徐徐倾入巳沸的蒸馏水中，煮沸至透明，冷却定容至 l00ml，此溶液需当天配制。（2）0.2mol/L pH4.6 醋酸钠缓冲液称取醋酸钠(CH3COONa·3H2O)2.722，用蒸馏水溶解，定容至 100m1。冰醋酸(CH3COOH)1.17m1 定容至 100ml。分别取醋酸钠 49ml 和醋酸 51ml 混匀。缓冲液以酸度计或精密试纸校正 pH。（3）20%氢氧化钠溶液（4）0.1mol/L 碘液称取碘化钾 35g 和碘 13g 溶解在 100m1 蒸馏水中，定容至 1000ml 贮存

于棕色瓶中。（5）0.1mo1/L 氢氧化钠溶液称取 4g 氢氧化钠加蒸馏水溶解，定容至1000ml。（6）1mol/L 硫酸溶液量取浓硫酸 5.6ml，慢慢加入于 80 m1 蒸馏水中，冷却后定容至 l00ml，摇匀。（7）0.1mol/L 硫代硫酸钠溶液配制：称取结晶硫代硫酸钠(Na2S2O3·5H2O)24.82g 和碳酸钠约 0.2g（硫代硫酸钠溶液在 pH9-10 时最稳定）溶于煮沸后冷却的蒸馏水中（无 CO2），定容至 1000ml，即得 0.1 mol/L 硫代硫酸钠溶液。贮于棕色瓶中密封保存，配制后应放置一星期标定使用。

实验步骤： 1．待测酶液的制备．取发酵液的滤液用 pH4.6 醋酸钠缓冲液适当稀释，供测定用。 2．酶活力的测定．于甲、乙两支管中，分别加入 2%可溶性淀粉溶液 25m1 及0.2mol/L pH4.6 的乙酸缓冲液 5ml，摇匀，在40℃的恒温水浴中预热 5-10min，在甲管中加入待测酶液 2ml(酶活总量约 100-170 单位)，乙管中加 2ml 蒸馏水作对照，摇匀，立即记时。准确反应 1h 后，取出各加 20%NaOH 溶液 0.2m1 终止酶反应，冷却至室温。取上述反应液 5m1 放入碘量瓶中，准确加入 0.1mol/L 碘液 10ml，再加入 0.1mol/L 氢氧化钠15ml，摇匀后暗处放置 15min。加入 1mol/L 硫酸 2m1，用 0.05mol/L 硫代硫酸钠滴定至无色为终点。其与空白消耗硫代硫酸钠毫升数的差值应在 4~6 之间，否则要适当调整酶液的稀释倍数。计算：计算：糖化酶活力单位的定义：在40℃、pH4.6 的条件下，1 小时水解可溶性淀粉产生 1 毫克葡萄糖所需的酶量为一个糖化酶活力单位。酶活力单位=

（A-B)N ×90.05 ×（1/2）×（32.2/5）×n 式中： A——空白所消耗硫代硫酸钠体积（ml）； B——样品所消耗硫代硫酸钠体积（ml）； N——硫代硫酸钠浓度（0.1mol/L）；

90.05 ——1ml l mol/L 硫代硫酸钠所相当的葡萄糖质（mg）； 1/2 ——折算成 1m1 酶液的量 32.2——反应液总体积（ml） 5 ——吸取反应液样品的体积（ml）； n ——酶液稀释倍数。注意事项：注意事项： 1）酶液制备时，酶液浓度最好控制在消耗 0.05mol/L 硫代硫酸钠（空白和样品）的差数为 3~6ml 左右(以每毫升约 50~90 单位为宜)。 2）配制碘液时碘先和碘化钾溶解，溶解完全后再稀释。

（五）酒精蒸馏与含量的测定: 酒精蒸馏与含量的测定比重计测定法： 1.材料：①酒精比重计。②100ml 量筒。③温度计。 2.操作：①蒸馏：装好全套蒸馏装置，用容量瓶量取 100ml 发酵液，放入 500ml 的蒸馏瓶中，加 100ml 水。迅速安装到冷凝管上进行蒸馏，并将此容量瓶用水洗净后，置冷凝管下端收集馏出液 100ml，停止蒸馏，摇匀备用。②测定：将酒精比重计慢慢放入酒精发酵液的蒸馏液中，手持温度计插在比重计杆旁，待温度稳定后，酒精停稳时读数，读数应以弯月面下缘为准，观察视线要与弯月面下缘相平。③校正：根

据所量的酒精度和温度、查表校正为20℃时酒精度。实际发酵产无水酒精发酵率（%）= 理论发酵产无水酒精×100 成熟发酵醪中含酒精 = 发酵液中糖份% × 0.6479 ×100 0.6479－发酵糖转化为酒精的转化系数（六）计算酒精出酒率葡萄糖发酵生成乙醇的反应式为：C6H12O6→2C2H5OH+2CO2 由于淀粉糖化液中几乎都是可发酵性糖，可按照上式算出糖醇转化的理论值。糖利用率=（实际所得酒精量/理论上所得酒精量）×100% 酒精对糖或对淀粉的转化率是衡量酒精生产水平的一项重要指标，直接影响生产成本。它与酵母的活性及用量、发酵时间、温度、pH 值及是否污染上杂菌等许多因素都有关，由于本实验没有最终获得酒精产品，所以，仅根据发酵醪体积和酒精含量估算转化率，也可利用 CO2 的产生量计算酒精产量并对结果应进行讨论。实际发酵产无水酒精发酵率（%）= 理论发酵产无水酒精×100% 成熟发酵醪中含酒精 = 发酵液中糖份% × 0.6479 ×100% 0.6479－发酵糖转化为酒精的转化系数淀粉出酒率=（发酵生产中的酒精总量/商品淀粉中的纯淀粉含量）×100% 淀粉利用率=（发酵生产中的酒精总量/理论上应得的酒精量）×100% 上式中，发酵生产出的酒精总含量可根据发酵醪和酒精含量估算，也可利用 CO2 的产生量计算酒精产量；一般商品淀粉中纯淀粉的含量为 81.12%；由 400g 商品淀粉出发发酵生产酒精时，理论上应得的酒精量，最后计算约为 184g。

五、实验结果 六、实验记录