1.基因(Gene)
遗传的基本单位，含有编码一种RNA，大多数情况是编码一种多肽的信息单位； 负载特定遗传信息的DNA片段，其结构包括由DNA编码序列、非编码调节序列和内含子组成的DNA区域。 2.基因表达(gene expression)
从DNA到蛋白质的过程。
对这个过程的调节即为基因表达调控(regulation of gene expression)。 3.基因表达的特点
时间特异性——发育阶段特异性 空间特异性——组织细胞特异性 4.基因表达调控的概念
机体各种细胞中含有的相同遗传信息(相同的结构基因)，根据机体的不同发育阶段、不同的组织细胞及不同的功能状态，选择性、程序性地表达特定数量的特定基因的过程。 5.基因表达的方式
1）组成性表达 (constitutive expression):基因较少受环境因素影响，而是在个体各个生长阶段的大多数或几乎全部组织中持续表达，或变化很小。如管家基因
★管家基因(housekeeping gene)：某些基因在一个个体的几乎所有细胞中持续表达。
2）诱导和阻遏表达
诱导表达(induction expression)——在特定环境信号刺激下，基因表现为开放或增强，表达产物增加。
阻遏表达(repression expression)——在特定环境信号刺激下，基因被抑制，从而使表达产物减少。
6.基因表达调控的意义
1）以适应环境、维持生长和增殖 2）以维持细胞分化与个体发育 7.原核生物基因表达的调控
8、真核生物基因表达的调控——多层次和复杂性
★转录前水平：染色体丢失、基因扩增、基因重排、DNA的甲基化、
组蛋白修饰、染色质结构
★转录水平:转录调控是通过各种调控元件相互作用来实现的，调控元件主要包括顺式作
用元件和反式作用因子。
★转录后水平：hnRNA的选择性加工运输、mRNA前体的选择性剪接、RNA编辑、RNAi ★翻译水平：翻译因子的磷酸化调控、mRNA稳定性调控 ★翻译后水平：蛋白质修饰 简单修饰：乙酰化、甲化和磷酸化
1）基因重排：将一个基因从远离启动子的地方移到距它很近的位点从而启动转录，这种方式被称为基因重排。例如，免疫球蛋白结构基因的表达。
2）CpG岛：在基因组的某些区域中，CpG序列密度很高，可以达均值的5倍以上，成为鸟嘌呤和胞嘧啶的富集区，形成所谓的CpG岛。哺乳类基因组中约存在4万个CG islands，大多位于基因的启动子区或是第一个外显子区。
3）组蛋白密码（histone code）: 组蛋白中被修饰氨基酸的种类、位置和修饰类型组成了组蛋白密码（histone code） 4）组蛋白修饰种类
● 乙酰化：大多发生在H3、H4的 Lys 残基上，一般与活化的染色质构型相关
甲基化：发生在H3、H4的 Lys 和 Asp 残基上，可以与基因抑制有关，也可以与
基因的激活相关，这往往取决于被修饰的位置和程度 磷酸化：发生与 Ser 残基，一般与基因活化相关 泛素化： 一般是C端Lys修饰，启动基因表达 SUMO（一种类泛素蛋白）化： 可稳定异染色质 5）顺式作用元件（cis-acting element）：与受调控基因处在同一染色体（DNA分子）上的DNA序列，能调控该基因的表达。包括：启动子（promoter）增强子（enhancer）沉默子（silencer）绝缘子（insulator）应答元件（response element） 6）反式作用因子（trans-acting factor）： 能与顺式作用元件结合的，调控基因表达的蛋白质或RNA（tRNA、rRNA等）。又称转录激活蛋白（transcription activator）、DNA结合蛋白（DNA binding protein）或转录因子（transcription factor，TF） 7)RNA编辑：我们把在RNA翻译为蛋白质之前，通过特殊的机制增减其碱基的数目或对已有的碱基进行修饰或替换叫做RNA编辑 。
8)微小RNA (microRNA，miRNA)：长度约20~25个碱基，由一段具有发夹环结构，长度为70~90个碱基的单链RNA前体经Dicer酶剪切后形成。 9)miRNA特点：
在不同生物体中普遍存在；
其序列在不同生物中具有一定的保守性； 具有明显的表达阶段特异性和组织特异性。
10)小干扰RNA (small interfering RNA, siRNA)：是细胞内一类双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)在特定情况下通过一定酶切机制，转变为具有特定长度(21~23个碱基)和特定序列的小片段RNA。 11）RNAi：由siRNA介导的基因表达抑制作用是转录后基因沉默（post-transcriptional gene silencing,PTGS) 被称为RNAi。 siRNA 和miRNA的差异比较：
二、疾病基因的定位与克隆
基因定位的基础——遗传标记、连锁与重组、致病基因（变异）的直接鉴定 1.遗传标记（genetic marker）：用连锁分析法进行基因定位时需要的一些已知遗传位点，这些位点按孟德尔方式遗传，具有多态性，本身并不致病，这些位点称为遗传标记（genetic marker）。
2. DNA多态性：在人群中，某一基因座上存在两种或两种以上的基因型，较少一种基因型出现的频率不低于1%，就称DNA多态性。
限制性内切酶片段长度多态性（RFLP） 重复序列拷贝数多态性（STR） 单核苷酸多态性（SNP） 拷贝数多态性 (CNP)
3.连锁分析(linkage analysis)：利用被定位的基因与同一染色体上另一遗传座位（多态性位点）相连锁的特点，将该基因定位在某一染色体或染色体某一区带上。
Lod值≥3表示肯定连锁 Lod值≤-2表示否定连锁
Lod值介于 +1 和 +3之间，支持连锁 Lod值介于 - 2 和 +1之间，不支持连锁
4. 重组(recombination)：同源染色体之间DNA的交换，常发生于减数分裂时。
重组值(recombination fraction)：是基因定位时两个基因座间遗传图距的量度，即基因间的遗传距离。
5.cM是遗传距离的基本单位
1cM代表重组值为1%，即两个基因座在减数分裂时发生重组的概率为1%，
1cM约等于1Mb。
重组值的最大取值为50%，意即两个距离50cM的基因座之间是不连锁传
递的，就像分别在不同的染色体上一样。
6.连锁分析实例
第一步就是要确定所有家系成员基因组中多态性遗传标记的基因型 第二部确定连锁的最大区域（define the maximal region of linkage） 第三部找致病基因和错义突变（pathogenic mutation）
检测区域内候选基因或着对所有基因进行DNA测序 7.致病基因/变异的直接鉴定
原位杂交 荧光原位杂交（FISH） 比较基因组杂交（CGH） 全基因组（全外显子组）测序 8、为什么研究单基因病？ 1)解释基因的功能
单基因遗传病是研究基因与人类疾病关系的最好的、不可替代的自然疾病模型。 采用小鼠遗传病模型研究基因的功能有许多局限。 2）发现新的遗传机制
单亲二体 uniparental disomy 遗传印记 parental imprinting 上位效应 epistatic interaction
表观遗传 epigenetics
三核苷酸扩增 trinucleotide repeat expansion 3）研究复杂的疾病模式
遗传异质性与表型异质性
表型复杂性：表型不一致的同卵双生子
同一个基因突变产生似复杂疾病的连续表型 4） 为复杂疾病的研究提供线索
APC基因：遗传性直肠癌——其它直肠癌 BRCA1基因：家族性乳腺癌——其它乳腺癌 APOA1, LCAT基因
低胆固醇血症：单基因病型——多基因病 5）为遗传病分子诊断奠定基础 单基因遗传病诊断 出生缺陷筛查 遗传病预防
个体化治疗指导
9、疾病基因定位与克隆策略
10、定位克隆(positional clone) ——适用于孟德尔遗传单基因疾病
四要素： 家系 遗传标记
连锁分析与基因定位 基因变异发掘及功能研究
11.复杂遗传病
12、遗传分析方法;
参数分析（模型依赖）——复合分离分析、连锁分析
非参数分析（非模型依赖）——受累同胞（亲属）对连锁分析 、连锁不平衡分析
关联研究——就是连锁不平衡分析 A分类：
群体为基础的关联研究病例-对照研究
疾病人群 (cases) 和对照人群 (controls). 比较两组人群中基因和基因型频率
家系为基础的关联研究
传递不平衡检验 (TDT) 收集患者及其父母的资料
比较患者及其父母的基因传递信息.
B肯定存在遗传标记与疾病关联的现象可归纳为两类：一种是致病基因位点与遗传标记位点存在很强的连锁不平衡；另一种是遗传标记位点本身与疾病发生相关。 C 不足之处：
13.SNP单体型（haplotype）
人类基因组中,相邻近的SNPs等位位点倾向于以一个整体遗传给后代。位于一条染色体上或某一区域的一组相关联的SNP 等位位点被称作单体型( haplotype) 14.小结：
三、多基因病
1.数量性状 （Quantitative trait）
性状的变异是连续的，相对性状存在着一系列的过渡型，个体间仅存在有数量或程度上的不同，无类型或本质的差别，决定数量性状的基因座为数量性状基因座 (QTL, quantitative trait locus) 。
质量性状 （Qualitative Trait ）
性状的变异在群体中的分是不连续的，称为质量性状。例如人类的白化病、豌豆植株的高矮等
2. 多基因遗传 ( Polygenetic Inheritance )
指生物和人类的许多表型性状由不同座位的较多基因协同决定，而非单一基因的作用，因而呈现数量变化的特征，故又称为数量性状遗传 3. 微效基因（Minor Gene ) ：
在多基因遗传中，每对基因对性状的效应是微小的，故称为微效基因；但是不同的微效基因可以通过累加作用而形成一个明显的表型性状，所以又称为累加基因 ( Additive Gene ) 4. 多因子遗传（Multifactorial inheritance ）
多基因遗传性状除受微效累加基因的作用外，还受环境因素的影响，因而是两种因素共同作用形成的一种性状，因此，这种遗传方式又称为多因子遗传 ★数量性状遗传特点
多基因作用的微效性 变异的连续性 分布的正态性 对环境的敏感性
5.易患性(liability)
在多基因遗传病中，遗传基础和环境因素的共同作用，决定一个个体患病可能性的大小，称易患性
6. 遗传率(h2) 多基因病中，易患性的高低受遗传基础和环境因素的双重影响，其中遗传基础所起作用的大小称为遗传率(h2) (heritability)。 7.多基因病的遗传特点
包括一些常见病和常见的畸形，发病率大多超过1/1000 发病有家族聚集倾向
发病率有种族(或民族)差异
患者双亲、同胞、子女亲缘系数相同，发病风险相同 随着亲属级别降低，发病风险迅速下降
近亲婚配，子女发病风险增高，但不如AR显著 8.多基因病遗传研究方法（结合二、11-14） 识别某种疾病病遗传因素的作用强弱 ↓
选择研究方法 ↓
家系材料：参数分析
散在人群：非参数分析、关联分析 小鼠：杂交分析、基因敲除
9.复杂疾病遗传学研究的意义
疾病机制（干预靶点） 治疗应答 预警预测
四 表观遗传学—1
1.
2.表观遗传的特点
3. （结合一、8）
4.表观遗传现象
五 表观遗传——DNA甲基化和组蛋白乙酰化
1. DNA甲基化：在DNA甲基转移酶 (DNA methyltransferase, DNMTs) 的作用下，将一个甲基添加到胞嘧啶的5’-碳分子上，形成5-甲基化胞嘧啶 (5-methylcytosine) ； 2. DNA甲基化的分布：
– (1)转座子 – (2) 逆转录病毒衍生的重复序列 – (3) 大多数功能基因的编码区 3.DNA甲基化的检测
• 1. 传统实验方法
– Methylation-sensitive restriction enzymes – Methylation-specific enzyme McrBC
• 2. 现代方法
– MeDIP: methylated DNA immunoprecipitation assay – MBD：methylation binding domain
• 3. DNA甲基化位点的确定：Bisulfite genomic sequencing 4.DNA甲基化的功能
宿主防御模型 (The Host Defence Model) 基因调控模型 (The Gene Regulation Model) 5.组蛋白的乙酰化
• 1. 通常发生在蛋白质的赖氨酸(K)上； • 2. 可逆的生化反应：
– A. Histone acetyltransferase，HAT (>30) – B. Histone deacetylase, HDAC (18)
• 3. 分子效应：中和赖氨酸上的正电荷，增加组蛋白与DNA的排斥力 • 4. 生物学功能：
– A. 基因转录活化 – B. DNA损伤修复
六 表观遗传——染色质的结构
1. 染色质重塑Chromatin Remodeling：遗传信息表达、复制和重组过程中，染色质的包装状态，核小体中的组蛋白以及对应的DNA分子会发生改变的分子机理。 2.染色体重塑的当前认识
• 1. 两类酶调控染色质重塑的过程：组蛋白修饰因子 (histone modifiers) 以及ATP
依赖的染色质重塑因子 (chromatin remodelers) • 2.组蛋白修饰因子并不改变核小体的位置，而是在DNA上作标记，以招募其他的活
性成分 (组蛋白密码)
• 3.染色质重塑因子：水解ATP释放能量，从而改变染色质的结构
七 遗传重组
1.突变（mutation）
− 基因组中小段区域内核苷酸序列的改变, 如替换、缺失、插入 − 突变效应:同义突变、错义突变、终止突变、连读突变 2.重组遗传重组（Genetic Recombination）
− 指遗传物质的交换和重排，其共有特征是DNA双螺旋之间的遗传物质发生交换 − 同源重组、位点专一性重组、转座、异常重组 1）同源性重组（Homologous recombination）
依赖大范围的DNA同源序列联会，重组过程中两个DNA大片段交换对等的部分 蛋白质因子对DNA序列的特异性要求不高；存在重组热点和序列长度的影响 真核生物染色质的状态影响重组的频率
发生于减数分裂时同源染色体非姐妹单体交换；细菌的转化、转导、结合；噬菌体
的重组等
条件：
在交换区具有相同或相似的序列 双链DNA分子间互补碱基进行配对 DNA分子断裂 重组酶
异源双链区的形成 模型：
Holliday 双链侵入模型
Meselson-Radding 单链侵入模型（见基因Ⅷ） 双链断裂修复模型（见基因Ⅷ） 同源性重组的应用：
基因打靶 、转基因、基因knock-out技术、重组工程 重组步骤 同源DNA联会及链侵入 大肠杆菌 RecA和SSB 真核细胞 Rad51， Dmc1（减数分裂） 引入双链断裂 作用于DNA断裂端以产生侵入的单链 Holliday junction组装 无 RecBCD：解旋酶/核酸酶 RecBCD RecFoR RuvA，RuvB RuvC 和Spo11（减数分裂期） MRX 蛋白（Rad50/58核酸酶） Rad52、 Rad59蛋白 Holliday junction 识别和分支移位 Holliday junction拆分 未知 可能是Mus81或其它 2）位点特异性重组（Site-special recombination）
是由整合酶催化，在两个DNA序列的特异位点间发生的重组 作用：
参与表达的调节
发育过程中程序性的DNA重排
有些病毒或者质粒复制循环过程中发生的整合与切除等等
3）转座重组（Transposition）
一段DNA序列不依赖序列的同源性从染色体的一个部位转移到同一染色体或其
它染色体的另一个部位。这种可移动的DNA片段称为可动基因（mobile gene），转座元件或转座因子（transposable element）
八 基因与个性化医疗
1.SNP (Single Nucleotide Polymorphism) ：
即单核苷酸多态性，是人类基因组中最常见的基因多态性，是继RFLP, STR之后的第
3代遗传学标记, 是个体差异的最基本因素，是功能基因组学、 疾病基因组学、药物基因组学和环境基因组学研究重要内容。 2.药物遗传学（pharmacogenetics）：
研究由于遗传背景的不同导致其对药物反应差异的学科称为药物遗传学。
研究群体间遗传变异所导致的药物反应的差异，通过研究遗传因素对药物代谢动力学的影响，重点研究与药物副作用相关的基因及其表达。 3.Pharmacogenomics(药物基因组学)
是更为广义的概念，是在整个基因组层面上研究药物反应的差异；还包含将人类基因组学的技术（如基因序列分析、大规模的基因表达分析和生物信息学）用于临床药物的开发和试验，其目的是为了检测、诊断和治疗导致疾病的遗传因素。 4.如何检测药物的遗传因素
基因转录组水平、基因转录组水平、基因组水平(多态性)、基因突变
5.多药耐药性（MDR）是指肿瘤细胞对一种抗癌药物耐药的同时，对其它结构和机制不同的药物也产生耐药性。
九 遗传工程小鼠与医学研究
1.为人为改造某些遗传性状,将外源基因或改造修饰的内源基因导入小鼠受精卵,产生携带此基因的小鼠品系,并能通过生殖细胞将其传递给后代的小鼠,称为遗传工程小鼠 2.真核细胞DNA转移技术
磷酸钙沉淀 脂质体输送 显微注射 电穿孔
3. 阳性选择：额外基因之一（neoR）赋予其新霉素抗性，它允许对细胞的阳性选择，无论发生的是同源（特定）还是非同源（随机）重组
阴性选择：第二个额外基因，由单纯疱疹病毒的胸苷激酶基因（tkHSV）赋予对gancyclovir（一种细胞毒性核苷酸类似物）的敏感性，该基因允许对发生非同源重组的ESCs进行阴性选择，只有经历同源重组（如外源DNA对基因靶向特异性插入）的ESCs才能在这种选择中存活下来 4. 分类：
Transgenics——转基因小鼠携带已随机整合到宿主基因组的克隆基因，大多数情况
下,这种技术不会导致内源性基因被置换，而是其额外拷贝的整合、
Knockout Mice——基因敲除小鼠是一种基因工程小鼠，向正常个体内引入某个突变等位基因而选择性地使某特定基因功能失活，可培养出靶向性剔除某基因的小鼠，而导致行为特性改变。
Knockin Mice——Knockin是在染色体特定基因座上靶向引入经改造的内源基因
(以基因突变为主),改变小鼠原有基因的表达，但是不破坏原有基因的结构完整性，只改变该基因的功能。
Knockdown Mice——为一种新的遗传工程小鼠，特色为身上所带有的RNAi会降低
或停止目标基因的表达，达到稳定的“gene knockdown”目的。
5.人类疾病动物模型分类
按产生原因分类：
自发性动物模型(spontaneous animal model)
诱发性动物模型(induced animal model)
遗传工程动物模型(genetically engineering animal model)
按系统范围分类
疾病的基本病理过程：炎症，肿瘤，休克
各系统疾病动物模型：心血管、呼吸、消化、职业病
按模型种类分类
整体动物、离体器官和组织、细胞株等
十 CNV
1.拷贝数目变异：CNV人类基因组中广泛存在的，从1000bp到3Mb范围内的缺失、插入、重复和复杂多位点的变异。 2.机制：
– NAHR非等位同源重组 – NHEJ非同源末端连接
– FoSTeS复制叉停滞和模板转换
– L1 retrotransposition L1介导的逆转录转座
3.
4.CNV特征
可遗传性、相对稳定性、 高度异质性 5.CNV关联分析 全基因组 候选区域 罕见CNV
尚有三场讲座
文献综述
一．结合疾病基因的定位和克隆知识
1 Clinical, neuroimaging and neuropathological features of a new chromosome 9p-linked FTD-ALS family——基因定位 ★重点，读懂系谱图，
Results——Genome-wide linkage analysis and identification of minimal linked region ——Mutation analysis of candidate genes Discussion——首段
——Refined localisation of the chromosome 9p FTD-ALS associated region 2 Expanded GGGGCC Hexanucleotide Repeat in Noncoding Region of C9ORF72 Cause Chromosome 9p-Linked FTD and ALS——基因鉴定 ★基本都要看
二．此为李新哲同学译文
全基因组失功能筛选表明蛋白酶体在 HDAC抑制剂诱导的凋亡中起重要作用
摘要：
异常乙酰化作用与肿瘤发生密切相关，靶向组蛋白去乙酰化酶(HDACs)对乙酰化进行调节作为一种可行的治疗策略正在跨步发展。通过全基因组范围失能筛选鉴定的HR23B，可以将泛素化的载物蛋白运输至蛋白酶体，它是HDAC抑制剂诱导凋亡敏感性的一个决定因素。HR23B也可以控制肿瘤细胞对直接作用于蛋白酶体的药物的敏感性。HR23B的水平影响了肿瘤细胞对HDAC抑制剂的反应，HR23B在原位皮肤T细胞淋巴瘤中高水平表达，此类恶性肿瘤对基于HDAC的治疗反应良好。这些结果提示蛋白酶体活性促进了HDAC抑制剂的抗癌活性。
引言：
异常的表观遗传调控是恶性表型获得的一个重要决定因素，这一共识使得发展以调控表观遗传通路为基础的药物来治疗肿瘤成为一项积极的研究。在表观遗传调控机制中，可逆的组蛋白乙酰化是一个关键基础。从抗癌制剂角度来说，进展最迅速的领域之一即是小分子HDAC抑制剂。从基于细胞的实验来看，HDAC抑制剂对肿瘤细胞增殖有显著作用，可以广泛促进凋亡的发生。因此，HDAC抑制剂已经进入临床研究。尽管临床前景不可预测，而且基于HDAC抑制剂的治疗很复杂，但当前很多类型的肿瘤对于此治疗反应良好。血液恶性肿瘤尤其敏感，在这一方面，伏地诺他(SAHA)已经在晚期皮肤T细胞淋巴瘤中展示了希望性的临床效果。
然而，HDAC抑制剂如何发挥抗肿瘤活性，HDAC抑制剂通过哪些关键机制和通路来阻滞肿瘤细胞增殖尚存疑问。尽管解除对染色质的控制很可能与杀肿瘤细胞有关，但是很多其他促进HDAC抑制剂细胞效应的机制和通路也有报道。而且，阐明控制杀肿瘤细胞的关键通路对搞清相应肿瘤的临床范围有帮助，后者大部分仍未明确。
正是在这种大背景下我们设计了一种全基因组失功能筛选来鉴别那些控制肿瘤细胞对HDAC抑制剂敏感性的基因。我们推测通过筛选鉴定出的基因可能为研究HDAC抑制剂作用的细胞通路和分子机制指明方向。结果得出了涉及到蛋白酶体尤其是有关HR23B的蛋白酶体靶向活性的一条重要功能通路和蛋白酶体在HDAC抑制剂诱导凋亡中的潜在作用。HR23B的水平影响了HDAC抑制剂处理的结果，蛋白酶体活性通过一条在HDAC抑制剂处理细胞中涉及到HR23B的通路被解除调控。我们的研究表明异常蛋白酶体活性促进了HDAC抑制剂的抗肿瘤活性，为鉴别出可以从基于HDAC抑制剂的治疗中临床获益的病人提供了一个合理的基础。
结果：
(1) HDAC抑制剂敏感型基因的失功能筛选
失功能筛选使用了一个可以靶向涉及大量人类癌症基因的shRNA文库，在这一文库中，延长处理时每个shRNA都可以强烈而特异性地诱导基因表达抑制。我们将筛选成型，使之可以鉴定影响U2OS细胞对HDAC抑制剂敏感性的基因。这一基本原理基于这样一个事实：HDAC抑制剂诱导凋亡所必须的沉默基因可以使细胞在药物存在的情况下存活。可以分离存活的细胞，鉴定相关基因，在功能性分析中证实作为HDAC抑制剂敏感性的决定因素；筛选的结果(图1A)。
我们将焦点聚集在一个靶向HR23B的shRNA载体，它赋予了U2OS细胞对HDAC抑制剂诱导凋亡的耐受。为了证实被shRNA序列命中的基因表达是否降低，我们研究了HR23B蛋白的水平。HR23B蛋白水平在稳定表达HR23B特异性shRNA的细胞中很低(图1B)。从稳定表达细胞获取的shRNA序列的作用被用来和一个命中相同序列(SP)的siRNA以及另外一个来自于不同HR23BRNA区域的siRNA(2)比较；两种siRNA均可以耗尽HR23B(图1C)。核纤层siRNA作为一种非相关基因特异性地控制siRNA。
为了证实HR23B在调控肿瘤细胞对HDAC抑制剂敏感性中的作用，我们使用两种HR23BsiRNAs对HDAC抑制剂诱导的凋亡进行干扰，从而评估去HR23B的效果。导入任一个抗HR23BRNA的siRNA，包括SPsiRNA，都可以降低U2OS细胞对HDAC抑制剂处理后凋亡反应的敏感性(图1D)。此外，来源于HR23B敲除小鼠的鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)比野生型对照对HDAC抑制剂诱导的凋亡更加不敏感(图1E)。HR23B是两个人类酿酒酵母Rad23的同系物之一。然而，HR23AsiRNA并不影响HDAC抑制剂诱导的凋亡(图1F和1G)，提示HR23A和HR23B在细HDAC抑制剂诱导的凋亡中发挥了不同的作用。
已经认识到HR23B在调控肿瘤细胞对HDAC抑制剂敏感性中发挥了重要功能，接下来就要评估HDAC抑制剂对于HR23B的作用。在用HDAC抑制剂SAHA处理的U2OS细胞中HR23B水平升高，它在HR23B免疫染色中显示了更高水平。在用HDAC抑制剂处理的多种其他细胞中也观察到了HR23B的升高，包括A2780(卵巢)，MCF7(乳腺),H460(肺)肿瘤细胞(图S2A)。其他HDAC抑制剂，包括PXD101和VPA(丙戊酸)，连同天然产物曲古抑菌素A(TSA)，对HR23B均有相同的作用，但对RNA水平没有明显作用(图2C和2D)。而且，HR23B是乙酰化了的，48h后在未处理和处理的细胞中都发生了乙酰化作用 (图2E和2F)，处理24h后乙酰化作用适度增强(图S2B)。所以，HR23B是依靠乙酰化机制来靶向作用的，它在HDAC抑制剂处理的细胞种是通过转录后机制进行调控的。
然而，评估其他种类尤其是那些也通过诱导凋亡来杀肿瘤细胞的制剂对于HR23B的调控作用也是很重要的，这可以排除HR23B是被药物诱导的凋亡普遍影响的这一可能性。在凋亡诱导环境下用不同抗肿瘤制剂，包括依托泊苷，博来霉素，阿霉素，紫外灯处理的细胞中(图S2C)，对HR23B水平影响甚微(图2G和2H)。 (2) HR23B在HDAC抑制剂处理的细胞中的作用
HR23B参加了NER(核苷酸剪切修复)，它与着色性干皮病互补蛋白(XPC)结合，然后后者与损伤的DNA互相作用。它还有另一个重要的作用：将泛素化的底物靶向到蛋白酶体上。定位在HR23B N末端区域的泛素样结构域与蛋白酶体相互作用，定位于中间部分和C末端区域的两个泛素相关结构域使HR23B将要降解的蛋白运输到蛋白酶体。为了更加明确HR23B与HDAC抑制剂敏感性相关的特性，我们研究了HDAC抑制剂对于XP4PA细胞的作用。XP4PA细胞XPC基因缺陷， NER活性较低，所以，在这些细胞中HR23B对于NER的重要性降低了。然而，XP4PA细胞与对照组人类M2C5成纤维细胞及U2OS细胞一样，对于HDAC抑制剂诱导的凋亡敏感。对照组的两类细胞正常表达XPC和NER活性(图3A和3Ba)，当用HDAC抑制剂处理后，与U2OS和M2C5细胞相比，类似地HR23B在XP4PA细胞中被诱导。这些结果表明HDAC抑制剂并不是通过依赖于NER活性的HR23B依赖性通路来诱导凋亡。
(3) HDAC抑制剂处理细胞中蛋白酶体活性
为了检验HDAC抑制剂是否影响HR23B和蛋白酶体的相互作用，我们研究了HR23B和蛋白酶体之间的联系。HR23B经由泛素样结构域与蛋白酶体交互作用，可以靶向运输蛋白到蛋白酶体。当免疫沉淀反应抗体是抗HR23B(4倍，图3Ca)时， HDAC抑制剂处理的细胞中结合到蛋白酶体的HR23B水平升高，当免疫沉淀反应抗体识别20S核心alpha6亚基(4倍，图3Cb)时，HR23B同样升高。当用HDAC处理后，可以观察到HR23B和S5a19S蛋白酶体亚基的相互作用加强。因此，在HDAC抑制剂处理细胞的中HR23B与蛋白酶体的联系增强。
为了证实蛋白酶体活性在HDAC抑制剂处理细胞中是异常的，我们使用了可以表达不稳定GFP(GFPu)的HEK293细胞系，在这种细胞中GFP被融合到Ch1降解子序列。Ch1序列通过泛素-蛋白酶体途径将其靶向到降解状态，使GFP不稳定。GFP水平独立地代表了蛋白酶体活性程度。与预期一样，GFPu在蛋白酶体抑制剂波替单抗存在的情况下是稳定的(图3D)，证明GFPu的水平反映了蛋白酶体降解蛋白的能力。一旦滴定了不同HDAC抑制剂(TSA，SAHA，PXD101)，与对照组处理相关的GFPu蛋白水平明显升高(图3E)。而且，并非改变的RNA水平导致GFPu水平的升高 (图3F)。
我们接下来评估HDAC抑制剂对于在体蛋白酶体活性的影响。从未处理细胞得来的纯化蛋白酶体没有直接被HDAC抑制剂影响，这与波替单抗的效果相反，后者可以拮抗蛋白酶体活性(图3Ga)。然而，从HDAC抑制剂处理细胞纯化而来的蛋白酶体降解蛋白活性下降了(图3Gb)，这与从GFPuHEK293细胞系得来的结果是一致的(图3E)，即在HDAC抑制剂处理细胞中蛋白酶体活性打了折扣。
为了研究HR23B对蛋白酶体活性的效应(HDAC抑制剂依赖性的)，我们将HR23BsiRNA导入GFPu1HEK293细胞系，以GFPu水平来监控其作用。一旦去HR23B，HDAC抑制剂处理的细胞中增强的GFPu水平即降低(图3H)。所以结果表明在HDAC抑制剂处理的细胞中HR23B阻碍了GFPu的降解。由于GFPu通过蛋白酶体来降解(图3D)，所以水平降低的HR23B在HDAC抑制剂处理细胞中恢复了蛋白酶体活性。
蛋白酶体日渐被公认为可行的癌症靶标，很多种类的干扰蛋白酶体活性的小分子药物或已经批准用于临床或在研发中。与HDAC抑制剂的方式相似，蛋白酶体抑制剂在肿瘤细胞造成了广泛的凋亡。由于HR23B很可能是造成HDAC抑制剂处理细胞中蛋白酶体活性改变的原因，我们猜测HR23B也可能影响细胞对于蛋白酶体抑制剂的敏感性。的确，在U2OS细胞中HR23BsiRNA将蛋白酶体抑制剂MG132诱导的凋亡水平显著降低(图4A-4C)。此外，一旦用蛋白酶体抑制剂MG132处理U2OS细胞，HR23B即被诱导(图2G，图4C)，达到与用HADC抑制剂处理的细胞中观察到的相似水平。所以HR23B在介导肿瘤细胞对于HADC抑制剂和蛋白酶体抑制剂药物的敏感性上发挥重要功能，表明HADC和蛋白酶体通路有交
叉。
(4) 临床CTCL活检中HR23B的表达
尽管在临床上哪种肿瘤对于HADC抑制剂有良好反应还是未知的，但血液恶性肿瘤皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)对基于HADC抑制剂的治疗特别敏感。我们评估来源于血液恶性肿瘤的肿瘤细胞系中HR23B的水平，然后评价其对HDAC抑制剂的敏感性。在来源于CTCL和多发性骨髓瘤(MM)的细胞系中，HR23B水平与细胞对SAHA的敏感性相关(图4D，图S2F)。依此，从患有CTCL的病人身上获得的临床活检中检测HR23B水平就很有意思。通过对活检证实了的CTCL，包括蕈样真菌病和它的白血病突变型Sezary综合征进行免疫组化检测，HR23B高表达(表1)。HR23B的表达定位于恶性CD3阳性T细胞和肿瘤群区域(图5)。由于某些CTCL活检表达低水平的HR23B(表1)，故HR23B高表达并非CTCL的普遍特征。而且，在存在活化T细胞的良性组织例如慢性皮炎中HR23B是低水平的(根据抗CD3染色)(表1，图6A)，所以HR23B的表达并非活化T细胞的一个标志。CTCL代表了对基于HADC抑制剂的治疗敏感的一类恶性肿瘤，HR23B在原位CTCL恶性T细胞中被高表达。 讨论
(1) 蛋白酶体和HDAC抑制剂
最初认为HDACs是一个主要通过调控组蛋白乙酰化从而作用于表观遗传水平的酶家族，所以HDAC抑制剂可以通过影响表观遗传调控来杀细胞。然而，很多种类的非组蛋白和非染色质相关蛋白已被发现可以进行乙酰化，故目前认为乙酰化是一个涉及转录后水平修饰的多效作用，而并非仅仅与表观遗传特别相关。我们的研究影响了HDAC抑制剂杀肿瘤细胞的机制。许多机制例如死亡受体的上调，对血管生成的影响，对细胞周期监测点的调控等可以解释HDAC抑制剂诱导的细胞死亡。本研究结果提高了异常的蛋白酶体活性促进杀细胞过程的可能性，用全基因组失功能筛选法挑选那些决定HDAC抑制剂诱导凋亡敏感性的基因中鉴定出的HR23B在介导HDAC抑制剂发挥效应中起到重要的功能作用。去HR23B尤其降低了肿瘤细胞对HDAC抑制剂所致凋亡的敏感性。HR23B可以将运载蛋白运输到蛋白酶体并参与NER，我们的研究表明蛋白酶体运输活性在HDAC抑制剂处理细胞中才是重要功能的那个。与此观点一致，在HDAC抑制剂处理的细胞中，HR23B和蛋白酶体之间的联系增加了，蛋白酶体的活性打了折扣。重要的是，HR23B的水平对蛋白酶体介导的蛋白质周转有着直接影响，因为去HR23B可以在HADC抑制剂处理的细胞中恢复蛋白酶体活性。故在HDAC抑制剂处理的细胞中涉及HR23B的机制调控蛋白酶体活性(图6B)。尽管这些结果并未排除其他可促进HDAC抑制剂诱导死亡的机制或者通路，但确实提示了HR23B和蛋白酶体是在HDAC抑制剂处理细胞中受到异常调控的通路的成分。 (2) HDAC抑制剂的临床应用
除了影响HDAC抑制剂处理的细胞，HR23B控制着肿瘤细胞对直接作用于蛋白酶体类药物的敏感性。这一现象很有趣，它支持了这一观点：HDAC抑制剂影响了蛋白酶体的活性， HDAC和蛋白酶体抑制剂通过交叉机制诱导了凋亡。尤其后点可以在临床中发挥重要作用，因为在临床要经常使用联合治疗以求最大效果。在一个涉及HDAC和蛋白酶体抑制剂的治疗中，药物剂量和使用时序的精妙平衡对于达到能够介导抗肿瘤活性的必要蛋白酶体抑制水平可能是必需的。
尽管有很多假设，HDAC抑制剂通过哪些机制在CTCL中发挥抗肿瘤活性仍未知。因此，CTCL是唯一类非常规地对HDAC抑制剂敏感的恶性肿瘤还是代表着仍需证明其敏感性的恶性肿瘤之一尚存疑问。由于2期概念验证临床研究成为可行的，使得评估这一重要问题也将变为可行。然而，临床实验是漫长的，同样重要的是，在没有可利用的生物标记情况下进行调查来预测肿瘤对于的治疗的反应是一项挑战性工作。如果可以鉴别出可预测模式的
生物标志，就很可能加速我们对反应性肿瘤临床范围的认识。
总之，我们使用了全基因组失功能筛选方法来探寻HDAC抑制剂诱导细胞死亡的机制。本研究开辟了一条方法路径，它与HDAC抑制剂处理细胞中改变的蛋白酶体活性和HR23B的蛋白酶体靶向活性相关。这个结果指明了可以应用蛋白酶体(可以促进基于HDAC抑制剂治疗的抗肿瘤活性)进行水平的控制管理。
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