实验用培养基适用性检查标准操作规程

起草人 Prepared by: 审核人 Reviewed by: 审核人 Reviewed by: 批准人 Approved by:

颁发部门 Issued by 替换文件 Replaced For 分发部门： Distributed to QC SOP-QC-562-02实验用培养基适用性检查标准操作规程 QA,QC 执行日期 Effective Date 复审日期 Review Date 分发号 Distribution No.:

质量部QD

批准日期 Date:

QA

审核日期 Date:

QC

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起草日期 Date:

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目的 Purpose

为保障微生物检验的准确性及相关工作特制定本规定。

范围 Scope

本程序适用于微生物限度测定培养基的适用性检查及相关工作。

职责 Responsibility

分析员：严格按照本操作规程执行。及时完成各类相关记录。在主管的指导下进行任何可能的OOS及偏差调查。 主管：监督本操作规程的执行。对检验员进行必要的培训。指导任何可能的OOS和偏差调查。

内容procedure

1 2

检验员应根据培养基配制程序或培养基各自的说明书配制培养基。 试验用菌种及培养基 2.1

菌种:

2.1.1 培养基灵敏度测试所用的菌株传代次数不得超过5代，从国家药检所或菌种保藏中心购买。 2.1.2 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)[ATCC 6633] 2.1.3 大肠埃希菌(Escherichia coli) [ATCC 8739]

2.1.4 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) [ATCC 6538] 2.1.5 白色念珠菌(Candida albicans) [ATCC 10231] 2.1.6 黑曲霉(Aspergillus niger)[ATCC 16404] 2.1.7 伤寒沙门菌(Salmonella) [ATCC 14028]

2.1.8 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) [ATCC 9027] 2.2

培养基

2.2.1 按照培养基说明书进行配制灭菌。

2.2.2 大豆酪蛋白消化肉汤 Soybean-Casein Digest Broth 2.2.3 大豆酪蛋白消化琼脂 Soybean-Casein Digest Agar 2.2.4 沙氏葡萄糖琼脂 Sabouraud Dextrose Agar

2.2.5 肠道菌增菌肉汤 Enterobacteria Enrichment Broth Mossel 2.2.6 紫红色胆汁葡萄糖琼脂 Violet Red Bile Glucose Agar 2.2.7 麦康凯肉汤 MacConkey Broth

2.2.8 麦康凯琼脂 MacConkey Agar

2.2.9 RV沙门氏菌富集肉汤 Rappaport Vassiliadis Salmonella Enrichment Broth 2.2.10 木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂 Xylose Lysine Deoxycholate Agar 2.2.11 甘露醇氯化钠琼脂培养基 Mannitol Salt Agar 2.3

微生物计数培养基的适用性检查

2.3.1 微生物计数用的成品培养基、由脱水培养基或按处方配制的培养基均应进行培养基适用性检查。 2.3.2 菌悬液的制备

名称 菌株制备 名称 菌株制备 名称 菌株制备 金黄色葡萄球菌ATCC 6538 大豆酪蛋白消化肉汤或大豆酪蛋白消化琼脂 30℃-35℃，18-24小时 枯草芽孢杆菌ATCC 6633 大豆酪蛋白消化肉汤或大豆酪蛋白消化琼脂 30℃-35℃，18-24小时 黑曲霉ATCC 16404 沙氏葡萄糖琼脂20℃-25℃，5-7天 或者直到形成良好的孢子状态 铜绿假单胞菌ATCC 9027 大豆酪蛋白消化肉汤或大豆酪蛋白消化琼脂 30℃-35℃，18-24小时 白色念珠菌ATCC 10231 沙氏葡萄糖琼脂 20℃-25℃，2-3天 2.3.3 上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液或pH7.2磷酸盐缓冲液制成每1ml含菌数不大于100cfu的菌悬

液，制备黑曲霉孢子悬浮液时，添加3-5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液或pH7.2磷酸盐缓冲液，将孢子洗脱。然后，用适宜方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%菌氯化钠溶液或pH7.2磷酸盐缓冲液制成每1ml含孢子数不大于100cfu的孢子悬液。菌悬液在室温下放置应在2小时内使用，若保存在2～8℃可在24小时内使用。黑曲霉孢子悬液可保存在2-8℃，在验证过的贮存期内使用。

2.4

大豆酪蛋白消化肉汤促生长试验

2.4.1 取以上前3种菌悬液各0.1ml(不大于100cfu)，分别注入灭过菌的含有10ml大豆酪蛋白消化肉汤的

试管中，于30℃-35℃培养不超过3天。同时用相应的上一批通过促生长试验的培养基替代被检培养基进行上述试验。培养结束后进行观察，如果肉眼能清晰看到的微生物的生长与上一批通过促生长试验的培养基的生长情形基本一致，则判定此培养基通过促生长试验。反之则判定此培养基不符合规定，未通过促生长试验。

2.5

大豆酪蛋白消化琼脂和沙氏葡萄糖琼脂促生长试验

2.5.1 取以上5种菌悬液各1ml（不大于于100cfu），分别注入无菌平皿中，立即倾注大豆酪蛋白消化琼

脂，每株试验菌平行制备2个平皿，混匀、凝固，置30℃-35℃培养不超过3天，计数，后2种菌悬液不超过5天，计数。再取后2种菌悬液各少于100cfu，分别注入无菌平皿中，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂，每株试验菌平行制备2个平皿，混匀、凝固，置20℃-25℃培养不超过5天，计数。同时用相应的上一批通过促生长试验的培养基替代被检培养基进行上述试验。进行促生长试验的培养

基平皿上，微生物生长情况必须与已通过促生长试验的培养基平皿上的微生物生长情况一致或者更好，同时将待测定的培养基上的菌落数与已通过促生长试验的培养基上的菌落数对比，两者之间的比值应处于70%-200%之间,则判定此培养基通过促生长试验；反之则判定该培养基不符合规定，未通过促生长试验。

2.6

控制菌测试所用培养基的适用性检查

2.6.1 控制菌检查用的成品培养基、由脱水培养基或按处方配制的培养基均应进行培养基适用性检查。 2.6.2 菌悬液的制备 序号 1 2 3 4 5 试验菌种 金黄色葡萄球菌ATCC 6538 铜绿假单胞菌 ATCC 9027 枯草芽孢杆菌 ATCC 6633 大肠埃希菌 ATCC 8739 鼠伤寒沙门菌 ATCC 14028 菌株培养 大豆酪蛋白消化肉汤或大豆酪蛋白消化琼脂 30℃-35℃，18-24小时 大豆酪蛋白消化肉汤或大豆酪蛋白消化琼脂 30℃-35℃，18-24小时 大豆酪蛋白消化肉汤或大豆酪蛋白消化琼脂 30℃-35℃，18-24小时 大豆酪蛋白消化肉汤或大豆酪蛋白消化琼脂 30℃-35℃，18-24小时 大豆酪蛋白消化肉汤或大豆酪蛋白消化琼脂 30℃-35℃，18-24小时 2.6.3 上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液或pH7.2磷酸盐缓冲液制成适宜浓度的菌悬液。菌悬液在室温下

放置应在2小时内使用，若保存在2～8℃可在24小时内使用。

2.6.4 控制菌检查用培养基的适用性检查项目包括培养基的促生长能力、抑制能力及指示能力的检查。各

培养基的检查测试项目及所用菌株见下表

控制菌检查 培养基 特性 促生长能力 抑制能力 紫红色胆汁葡萄糖琼脂 促生长能力+指示能力 促生长能力 抑制能力 促生长能力+指示能力 促生长能力 抑制能力 促生长能力+指示能力 促生长能力 抑制能力 促生长能力+指示能力 抑制能力 试验菌株 大肠埃希菌 铜绿假单胞菌 金黄色葡萄球菌 大肠埃希菌 铜绿假单胞菌 大肠埃希菌 金黄色葡萄球菌 大肠埃希菌 鼠伤寒沙门菌 金黄色葡萄球菌 鼠伤寒沙门菌 铜绿假单胞菌 大肠埃希菌 金黄色葡萄球菌 大肠埃希菌 胆汁耐受革兰氏阴性菌的检测 肠道菌增菌肉汤培养基 大肠杆菌的检测 麦康凯肉汤 麦康凯琼脂培养基 RV沙门氏菌富集肉汤 沙门氏菌的检测 木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂培养基 铜绿假单胞菌的检测 金黄色葡萄球菌的检测 溴化十六烷三甲基铵琼脂 甘露醇氯化钠琼脂培养基 2.7 液体培养基促生长能力检查

取试验菌各0.1ml（含菌数不大于100cfu）（见上表）于被检培养基和上一批检验并通过的培养基中，在相应控制菌检查规定的培养温度及最短培养时间下培养。两者比较，被检培养基与上一批检验并通过的培养基比较，微生物生长良好并且相当。

2.8 固体培养基促生长能力检查

取试验菌各0.1ml（含菌数不大于100cfu）（见上表）分别涂布于被检培养基和上一批检验并通过的培养基中，在相应控制菌检查规定的培养温度及最短培养时间下培养。两者比较，被检培养基与上一批检验并通过的培养基比较，微生物生长良好并且相当。

2.9 液体培养基和固体培养基的抑制能力检查

取试验菌各0.1ml（含菌数不小于100cfu）（见上表）于被检培养基中，在相应控制菌检查规定的培养温度及最长时间下培养，试验菌应不得生长。

2.10 培养基指示能力检查

取试验菌各0.1ml（含菌数不大于100cfu）（见上表）分别涂布于被检培养基和上一批检验并通过的培养基中，在相应控制菌检查规定的培养温度及时间范围内培养。被检培养基中生长的菌落在外观和指示反应上与从此前已检测并批准的培养基批次所获得的菌落是相当的。

3

参考文件

Current USP、BP、EP

附件及相关文件Attachment and related documents

R01 微生物计数固体培养基适用性检查记录 R02 微生物计数液体培养基适用性检查记录 R03 微生物控制菌培养基适用性检查记录

历史History

修订号 00

生效日期 修订内容 1.培养基促生长、抑制能力等规定了试验菌的取样量。 附件编号Attachment No.:R01 微生物计数固体培养基适用性检查记录

Growth promotion test of solid media for Microbial enumeration test 培养基名称 培养温度 1 操作步骤 1.1使用0.9%无菌氯化钠溶液或磷酸盐缓冲液制备测试菌悬液，制备黑曲霉孢子悬浮液时，可以添加0.05%的聚山梨脂80到缓冲液中。测试菌悬液应在两小时内使用，或者在2-8℃的条件下24小时内使用。 1.2取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉5种菌悬液各少于100cfu，分别注入无菌平皿中，立即倾注大豆酪蛋白消化琼脂，每株试验菌平行制备2个平皿，混匀、凝固，置30℃-35℃培养不超过3天，计数；后2种菌悬液不超过5天，计数。再取后2种菌悬液各少于100cfu，分别注入无菌平皿中，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂，每株试验菌平行制备2个平皿，混匀、凝固，置20℃-25℃培养不超过5天，计数。取铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌2种菌悬液各少于100cfu，分别注入无菌平皿中，立即倾注R2A, 每株试验菌平行制备2个平皿，混匀、凝固，置30℃-35℃培养不超过3天。同时用相应的上一批通过促生长测试的培养基替代被检培养基进行上述试验。 1.3进行促生长试验的培养基平皿上，微生物生长情况必须与已通过促生长测试的培养基平皿上的微生物生长情况一致或者更好，同时将待测定的培养基上的菌落数与已通过促生长测试的培养基上的菌落数对比，两者之间的比值应处于70%-200%之间,则判定此培养基通过促生长测试；反之则判定该培养基不符合规定，未通过促生长测试。 2 记录： 菌种 菌液批号 开始培养结束培养测试培养基菌落数 平均 对照培养基菌落数 平皿1 平皿2 平均 对比生长情况（基两者比值时间/温度 时间/温度 平皿1 平皿2 本一致或更好） （70%-200%之间） 观察员 结果判定 厂家/批号 培养箱编号 有效期至 配制后批号 对照批号

检验日期 检验员 有效期至 有效期至 附件编号Attachment No.:R02

微生物计数液体培养基适用性检查记录

Growth promotion test of liquid media for Microbial enumeration test 培养基名称 配制后批号 对照批号 1 操作步骤 1.1使用0.9%无菌氯化钠溶液或PH7.2磷酸盐缓冲液制备测试菌悬液。测试菌悬液应在两小时内使用，或者在2-8℃的条件下24小时内使用。 1.2取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌3种菌悬液各少于100cfu，分别注入灭过菌的含有10ml大豆酪蛋白消化肉汤的试管中，于30℃-35℃培养不超过3天。同时用相应的上一批通过促生长测试的培养基替代被检培养基进行上述试验。培养结束后进行观察。 1.3如果肉眼能清晰看到的微生物的生长与上一批通过灵敏度测试的培养基的生长情形相同的话，则判定此培养基通过促生长测试。反之则判定此培养基不符合规定，未通过促生长测试。 2 记录：开始培养时间/温度___________________ 结束培养时间/温度____________________ 菌种 菌液 批号 测试培养基 生长情况 对照培养基 生长情况 对比生长情况（基本一致或更好） 观察员 结果判定 □符合□不符合 □符合□不符合 □符合□不符合 有效期至 有效期至 厂 家 培养箱编号 检验员

批 号 有效期至 检验日期

附件编号Attachment No.:R03 微生物控制菌培养基适用性检查记录

Growth promotion test of media for Specified Microorganisms tests 培养基名称 培养温度 1 操作步骤 1.1使用0.9%无菌氯化钠溶液或PH7.2磷酸盐缓冲液制备菌悬液，菌悬液在室温下放置应在2小时内使用，若保存在2～8℃可在24小时内使用。 1.2液体培养基促生长能力检查：分别接种不大于100cfu的试验菌于被检培养基和上一批检验并通过的培养基中，在相应控制菌检查规定的培养温度及最短培养时间下培养。两者比较，被检培养基与上一批检验并通过适用性检查的培养基比较，微生物生长良好并且相当。 1.3固体培养基促生长能力检查：取试验菌各0.1ml（含菌数不大于100cfu）分别涂布于被检培养基和上一批检验并通过的培养基中，在相应控制菌检查规定的培养温度及最短培养时间下培养。两者比较，被检培养基与上一批检验并通过适用性检查的培养基比较，被检培养基与对照培养基上生长的菌落大小、形态特征应一致。 1.4液体培养基和固体培养基的抑制能力检查：接种不少于 100cfu的试验菌于被检培养基中，在相应控制菌检查规定的培养温度及最长时间下培养，试验菌应不得生长。 1.5培养基指示能力检查：取试验菌各0.1ml（含菌数不大于100cfu）分别涂布于被检培养基和上一批检验并通过适用性检查的培养基中，在相应控制菌检查规定的培养温度及时间范围内培养。被检培养基中生长的菌落大小、形态特征、指示剂反应上与对照培养基一致。 2 记录 控制菌检查 检查项目 □促生长能力 □指示能力 □抑制能力 □符合□不符合 □符合□不符合 菌种 菌液批号 培养温度 开始培养时间 结束培养时间 生长情况描述 观察员 结果判定 □符合□不符合 厂家/批号 培养箱编号 有效期至 配制后批号 对照批号 有效期至 有效期至 检验日期 检验员